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1、毛细管电泳方法快速检测肺癌组织 p53 基因第 249 位密码子点突变研究辛晓婷1，王荣 2，刘勇 11 兰州大学生命科学学院，兰州（730000）2 兰州军区兰州总医院药材科，兰州（730050）E-mail：rhea1001摘要：目的：p53 基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用，检测基因点突变的方法学 研究将有助于临床准确诊断肺癌。方法：运用毛细管电泳（CE）与聚丙烯酰胺电泳（PAGE） 两种方法对肺癌及癌旁正常组织 p53 基因第 249 位密码子点突变进行检测，并对其检测结果 进行比较。PAGE 以 15%聚丙烯酰胺作为分离胶；毛细管电泳分离条件为 2.0甲基纤维素（MC）（pH8
2、.0）筛分介质，分离温度 25，电场强度 200V/cm。结果：用毛细管电泳和 聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法均能检测到 p53 基因第 249 位密码子点突变，而且毛细管电泳 方法检测时间短，且检测率高。结论：毛细管电泳可为大规模进行肺癌的早期诊断提供简便 可靠的方法。关键词：毛细管电泳；限制性片段长度多态性；p53 基因；点突变 中图分类号：Q5031引言肺癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，随着对肺癌发病机理研究的深入， 已发现肺癌的发生发展是一个多基因参与的多步骤的复杂过程，同时，在肺癌的发生发展过 程中与基因突变有着紧密的联系，检测与肺癌相关基因的突变点，对于肺癌早期诊断具有重
3、要意义。据报道在肺癌的发生和发展过程中 p53 基因突变是主要的，其中 p53 基因的第 249 位密码子是突变热点1-6。而限制性片段长度多态性（RFLP）分析被用于检测的基因突变， 当 DNA 序列的变异发生在限制性内切酶识别位点，或当 DNA 片段的插入、缺失或重复， 使基因组 DNA 经限制性内切酶水解后发生片段长度改变时，均可使用此方法，常用的琼脂 糖凝胶或聚丙烯酰胺（PAGE）电泳进行限制性内切酶水解后发生片段长度，但是这些方法 鉴别诊断无论在效率还是结果判断的准确性和灵敏度方面已不能满足临床的需要。毛细管电泳（CE）在分离方面的高效、快速、灵敏度高具有特点7-8已在分子生物学、
4、分子医学和生命科学方面应用日益广泛，在 DNA 片段的分离和检测方面的应用尤为广泛9。 分离检测 DNA 片段时筛选良好的筛分介质是得到良好分离和提高检测灵敏度的关键，有研 究证明甲基纤维素（MC）是一种良好的筛分介质10，因此本实验以 MC 为筛分介质，通过 优化 CE 过程中温度、电压、筛分介质 MC 浓度、pH 值获得了最佳分离条件11，本研究以 此分离条件为基础检测了肺癌 p53 基因第 249 位密码子的突变，并将分离结果与聚丙烯酰胺 电泳检测 p53 基因第 249 位密码子的突变结果进行对比，为检测基因突变点提供新的方法学。2资料与方法2.1 仪器P/ACE System 500
5、0 型毛细管电泳仪、P/ACE System 5000 station 数据处理软件、P/ACE System laser module 488nm 激光发射器（美国 Beckman 公司）；石英毛细管柱（河北永年光1本课题得到国家自然基金面上项目（No.20775089）的资助。- 1 -导纤维厂）；PCR 扩增仪（ABI 公司）; 高速离心机（德国 Heraeus 公司）；真空干燥箱。2.2 试剂丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）（国药集团化学试剂有限公司）；-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷（MAPS）（Johson Matthey公司）；核酸染料SYBR Green
6、（厦门百维信公司）；TaqDNA聚合酶、PCR试剂、Hae内切酶（TaKaRa）；pUC19DNA/Msp(Hpa) DNA Marker（MBI Fermentas）。2.3 研究对象肺癌及癌旁正常组织各 38 例取自兰州军区兰州总医院病理科，男 32 例，女 8 例，年龄33-75 岁，平均年龄 58.6 岁，所有肺癌病例均经病理切片证实。2.4 组织 DNA 提取，引物的设计及 PCR 扩增酚氯仿法提取肺癌及癌旁正常组织基因组 DNA。运用 PP5.0 软件设计 PCR 扩增引物， p53 基因 249 位密码子点突变能引起 Hae酶切位点（GGCC）的消失。扩增引物由上海生 工合成：上
7、游：5-CCT GTG TTA TCT CCT AGG TTG G-3，下游：5-TCC AGT GTG ATG ATG GTG AG-3，扩增片段长度为 118bp。PCR 扩增体系 25L 扩增体系中含有：dNTP 200L、引物 0.05mol/L、TaqDNA 聚合酶0.5U/L、DNA 模板 20mg/L；PCR 反应循环条件：94变性 30s，60退火 30s，72延伸30s，共 35 个循环。PCR 扩增产物均经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实。2.5 RFLP-PAGE 方法检测 PCR 产物按照引物设计原则，PCR 扩增产物经限制性酶 Hae酶切 PCR 扩增产物，249 野生型 将存
8、在 92bp、26bp 2 条片段；249 突变型将存在 118bp 1 条片段。酶切体系（20L）中含有： Hae5U、PCR 产物 8L、三蒸水 9L、缓冲液 2L。37水浴 1h，然后升至 80灭活 20min。酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 15聚丙烯酰胺凝胶电泳，上样，125V 电压 开始电泳，待样品跑出上样槽后，电压降为 103V，电泳 5 小时左右；聚丙烯酰胺凝胶电泳 用常规硝酸银染色显示 DNA 带纹；染色后观察肺癌组织与自体肺正常组织样本电泳条带的 异同、增加、减少或位置移动，以此来判断是否存在基因突变点。以正常肺组织扩增产物作 对照，肺癌组织与正常组织对比酶切产物分析
9、，用凝胶成像分析系统扫描（见图 1）。将其 结果进行分类分析。2.6 RFLP-CE 方法检测 PCR 产物同理按照引物设计原则，经限制性酶 Hae切割 PCR 扩增产物，249 野生型将存在 92bp、26bp 2 条片段；249 突变型将存在 118bp 1 条片段。 对酶切产物进行毛细管电泳分析，甲基纤维素（methyl cellulose，MC）作为筛分介质，参考文献11获得的最佳分离条件：涂层内径 50m 的毛细管柱 37cm，激光诱导荧光检测器 检测（ex488nm，em520nm），P/ACE System station 数据处理软件采集数据，MC 浓度2.0，pH 值 8.0
10、，毛细管温度 25，电场强度为 200V/cm11。染料 SYBR Green与 DNA样品混匀一起负极电动进样。- 6 -3结果3.1RFLP-PAGE 结果将所扩增的 DNA 样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用凝胶成像分析系统扫描。用限 制性酶 Hae切割 PCR 扩增产物后，p53 基因第 249 位密码子的野生型为 92bp、26bp 2 条 片段；突变型形成 118bp 1 条片段。电泳后条带与 pUC19 DNA/Msp(Hpa) DNA Marker 对比显示为目的条带（图 1）。118bp92bp147bp111bp110bp67bp图 1 PAGE 法检测肺癌 p53 基因第
11、 249 位密码子3.2 CE 分离 Marker 结果将 CE 过程中的温度，电场强度，以及筛分介质 MC 的浓度和 pH 值进行优化，得到最 佳分离条件为 MC 浓度 2.0，pH 值 8.0，毛细管温度 25，电场强度为 200V/cm。用优化 条件的毛细管电泳分离 pUC19 DNA/Msp(Hpa) DNA Marker（图 2），结果表明 pUC19DNA/Msp(Hpa) DNA Marker 的 11 个 DNA 片段得到了基线分离。5.0RF2.5U0.01 23109871146105.0987112.54651 230.05101520 t/min图 2 毛细管电泳分析
12、pUC19 DNA/Msp(Hpa) DNA Marker 电泳图谱1.26bp;2.34bp;3.67bp;4.110,111bp;5.147bp;6.190bp;7.242bp;8.331bp;9.404bp;10.489bp; 11.501bp3.3 CE 检测样品结果在上述分离条件下，CE 检测肺癌组织及癌旁正常组织的 PCR 扩增的酶切产物，分析肺 癌 p53 基因 249 位密码子点突变基因情况，结果见图 3，其中图 3a 为 249 位密码子野生型电泳图，图 3b 为 249 位密码子突变型电泳图，电泳图表明酶切产物均能得到基线分离；同时 CE 方法（图 3）在 20 分钟内完成
13、了肺癌及癌旁正常组织 p53 基因第 249 位密码子突变的 检测。a92bpba b92bpa92bpba 92bp b118bp118bp118bp118bp26bp26bp26bp26bp12.515.0 t/min12.5 15.017.5t/min图 3 RFLP-CE 分离 DNA 样品电泳图a.249 位密码子野生型电泳图；b.249 位密码子突变型电泳图3.4 肺癌细胞病理分型中 p53 基因第 249 位密码子点突变76 例肺癌及癌旁正常组织 p53 基因第 249 位密码子经 PCR 扩增均获得成功。扩增产物 经 Hae酶切后，酶切产物均经 RFLP-CE 和 RFLP-P
14、AGE 两种方法分别检测，比较了 RFLP-CE 和 RFLP-PAGE 两种方法检测 p53 基因第 249 位密码子经 PCR 扩增，并将检测结 果按照肺癌细胞病理分型进行了分类结果见表 1。表 1 CE 和 PAGE 检测肺癌按病理学分类的 p53 基因突变PAGECE细胞病理类型例数野生型突变型突变率（%） 野生型突变型突变率（%）非小细 胞肺癌鳞状细胞癌2318521.7417626.09腺癌54120.003240.00鳞-腺混合癌110001100小细胞肺癌9900900正常肺组织38380038003.5 病理分级中 p53 基因第 249 位密码子点突变76 例肺癌及癌旁正常
15、组织 p53 基因第 249 位密码子扩增产物经 Hae酶切后，酶切产 物均经 RFLP-CE 和 RFLP-PAGE 两种方法分别检测，并将检测结果按照病理分级进行了分 类结果见表 2，由表 2 可以看出非小细胞肺癌（NSCLC）p53 基因第 249 位密码子点突变与 肺癌分化无关，经检验差异无显著性(p0.05)。表 2 CE 和 PAGE 检测肺癌按病理分级的 p53 基因突变病理分级例数野生型突变型突变率（%）野生型突变型突变率（%）高度分化10110001100中度分化3300300低度分化110001100高度分化53240.003240.00中度分化1412214.291132
16、1.43低度分化43125.003125.00PAGECE腺癌鳞癌4讨论p53 基因是肿瘤抑癌基因，定位于人类第 17 号染色体短臂 17p3.1 处；正常 p53 基因抑制 细胞生长与分裂，而突变型不仅引起 p53 抑癌活性的丧失，反而具有促进恶性转化的活性， 由抑癌基因转变成癌基因。对 p53 基因中突变点的检测方法的研究，将会对深入研究 p53 基因在肺癌重要性有很大的理论价值。本文分别采用 RFLP-PAGE 和 RFLP-CE 两种分析方法检测人肺癌及癌旁正常组织中 p53基因第 249 位密码子点突变情况。用 RFLP-PAGE 技术对 DNA 样品进行检测，但这种技术需要大量的试
17、剂和样品，操作 复杂，分析时间长，不适合临床大量样品的分析，而且使用它根本无法准确检测小片段 DNA 之间的差异（图 1）。RFLP-CE 是一种电泳与色谱相结合的分析分离技术，而且比 RFLP-PAGE 有灵敏性好、分辨率高、样品用量少、自动化程度高的优点（图 2）。因此，用 RFLP-PAGE 检测不到 26bp 这个片段，而用 RFLP-CE 可以检测到 26bp 这个片段。而且 RFLP-CE 在 20min 内检测便能检测到 p53 第 249 位密码子的突变情况（图 3）。同时，表 1 说明分别用 RFLP-CE 和 RFLP-PAGE 两种方法检测肺癌 p53 基因第 249 位
18、密码 子的突变，RFLP-CE 和 RFLP-PAGE 检测非小细胞肺癌的点突变率分别为 31.03（9/29）和20.69（6/29），即 RFLP-CE 检测基因突变率明显高于 RFLP-PAGE。将 PCR-RFLP 分析与 CE 技术结合来检测肺癌中 p53 基因 249 位密码子点突变基因的方法是一种更快、更简单、更灵 敏、自动化程度高的筛查肺癌 p53 基因 249 位密码子点突变基因的方法，具有重要的理论价 值和实际应用意义12。两种方法检测小细胞肺癌和正常肺组织则均无 1 例点突变（表 1），由此可以看出 p53 基因第 249 位密码子突变是非小细胞肺癌点突变方式之一，而不是
19、小细胞肺癌突变热点，这 与文献报道一致13。而且 NSCLC p53 基因第 249 位密码子点突变与肺癌分化程度无关（p0.05），这与国外文献报道一致14。参考文献1 Hilbe W，Dlaska M，Duba HC，et alAutomated rea1-time PCR to determine K-ras codon 12 mutations in non-small cell lung cancer：comparison with immunohistcchemistry and clinico-pathological featuresJInt J Oncol，2003，23：1
20、121-11262Gealy R，Zhang L，Siegfied JM，et al. Comparison of mutations in the p53and K-ras genes in lung carcinomas from smoking and nonsmoking womenJCancer Epidemiol Biomarkers Prev，1999，8：297-3023Dai Y，Morishita Y，Mase K，et alApplication of the p53 and K-ras gene mutation patterns for cytologic diagn
21、osis of recurrent lung carcinomasJCancer，2000，90：258-2634Patel JD，Bach PB，Kris MG1ung cancer in US women：a contemporary epidemicJJAMA，2004，291：1763-17685王岳松，蔓新新，纪树国 等.肺癌 p53 基因突变与临床病理关系的研究J.临床与实验病理学杂志，1997，13：98-100.6陈巧云，王荣，贾正平 等.毛细管电泳-限制性片段长度多态性快速检测胃癌组织中 p53 基因点突变的方 法J.分析化学，2007，9：1305-1308.7Ren JC
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25、rview of genetic and molecular event in the pathogenesis of lung cancerJ.Chest，1993，103：1-3.Fast Detection of the 249 coden of p53 Gene point Mutation of lung Cancer by Restriction Fragment Length Polymorphism with Capillary ElectrophoresisXin Xiaoting1，Wang Rong2，Liu Yong11 Institute of Life Scienc
26、e, Lanzhou University, Lanzhou (730000)2 Medical Material Department, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, Lanzhou(730050)AbstractObjective：P53 gene point mutation is important in lung cancer. Compare the result of the 249 coden ofp53 Gene point Mutation by Polyacrylamide Gel Electrophoresis(P
27、AGE) and CapillaryElectrophoresis(CE).Methods：Detect the 249 coden of lung cancer and normal lung tissue p53 Genepoint Mutation by PAGE and CE simultaneously. The separation gel of PAGE is 15% PolyacrylamideGel. The condition of CE was 2.0（pH8.0） Methyl Cellulose(MC)，separation temperature at25，elec
28、tric field strength at 200V/cm.Results：The CE and PAGE can both detect the 249 coden of p53 Gene point Mutation. The detection time of CE is short，and detection rate is high.Conclusion：CEcan offer a convenient and reliable method to the large scale of early diagnosis of lung cancer. Keywords: Capillary Electrophoresis; Restriction Fragment Length Polymorphism; p53 gene; point mutation
