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1、精品论文维甲酸诱导腭裂小鼠出生前后 Wnt 通路相关信号分子的表达吴慧，刘涵，丛蔚，肖晶5（大连医科大学口腔医学院，大连，116044）摘要：目的：Wnt、Shh 和 BMP 等信号分子通路中的重要基因被证实参与到维甲酸致腭裂的过程中。本实验通过验证课题组前期完成的维甲酸诱导腭裂小鼠腭组织全基因组筛选中获 得的 Wnt 信号分子通路相关基因 GSK-3 、Fzd3 和 -TrCP，从而观察其在正常腭突发育和10腭裂形成出生前后表达变化。探讨维甲酸诱导腭裂小鼠出生后对 Wnt 通路的影响。方法： 建立维甲酸诱导小鼠腭裂模型。检测 GSK-3 ，Fzd3 及 -TrCP 的 mRNA 表达水平与蛋
2、白 表达部位。结果：1. 出生前后 GSK-3 、Fzd3 和 -TrCP mRNA 表达水平。GSK-3 、Fzd3和 -TrCP 在出生前后、正常腭突及维甲酸诱导腭裂中均具有显著性差异。2. 出生后蛋白 分布。WT 组中 GSK-3 、Fzd3 和 -TrCP 蛋白表达在腭突上皮，口腔侧腭上皮表达水平较15强，在腭间充质中 -TrCP 呈弱表达。RA 组中 GSK-3 、Fzd3 和 -TrCP 蛋白强表达在腭 间充质和腭突上皮，尤其是腭中嵴及口腔侧上皮表达水平更强。结论：出生后维甲酸诱导腭 裂小鼠腭上皮中 GSK-3 、Fzd3 和 -TrCP 等 Wnt 通路抑制因子表达水平上调，提示
3、维甲酸可能通过调控上述基因而对 Wnt 信号分子通路的活化具有抑制作用。关键词：腭裂；维甲酸；Wnt 信号通路；动物模型20中图分类号：R782.2+2Expression of Signaling Molecules Related to Wnt Pathway in Cleft Palate Induced by Retinoic Acid during Perinatal Stage25WU Hui, LIU Han, CONG Wei, XIAO Jing(Department of Oral Biology, College of Stomatology, Dalian Medica
4、l University, Dalian,116044)Abstract: Objective: Signaling pathways have been shown to participate in the process of Retinoic acid (RA) - induced cleft palate (CP). In our current study, the signaling molecules of GSK-3,30Fzd3 and -TrCP, which all relate with Wnt pathway, were screened from the pala
5、te tissues of the RA-induced CP in mice by the Gene-chip Technology. But, their expression pattern and level in palates during perinatal stages have not been known yet. Method and results: In the studies, mRNA level of GSK-3, Fzd3 and -TrCP were detected by quantitative real-time PCR, and showed sig
6、nificant difference between the Embryonic day 18 (ED18) before birth and Postnatal35day 0 (PD0) after birth, as well as between the RA-induced CP and wild type during the perinatal stage, respectively. And the localization pattern of GSK-3, Fzd3 and -TrCP proteins in palates was also characterized.
7、Conclusions: Our data indicates that the Wnt signaling pathway may involve in the RA-induced cleft palate during peirnatal stage.Key words: Cleft palate; Retinoic acid; Wnt Signals; Animal model;40基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20092105110006）作者简介：吴慧（1985-），女，医师，主要研究方向：口腔颌面发育通信联系人：肖晶（1969-），女，教授，主要研究方向：口腔颌面发育
8、. E-mail: xiaoj- 7 -0引言腭裂（Cleft Palate，CP）为新生儿中较为常见的先天性颅面部发育畸形。腭裂的病因极 其复杂，是由遗传因素与环境因素交互作用所致的多基因易感性疾病。环境因素作为诱变剂 诱导基因的突变或直接影响蛋白质结构等细胞成分的合成，进而影响细胞的正常生长、分化45及迁移等事件，从而导致腭裂的发生。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, atRA）是维生 素 A 的衍生物，已被证明是致畸作用显著的环境因素之一1。RA 主要由维甲酸受体介导发 挥功能，并且和受体在细胞核内的表达密切相关。维甲酸致小鼠腭裂主要是通过干扰 DNA 合成而
9、抑制腭突间充质细胞的增殖及过度凋亡。Wnt 信号通路是生物早期发育过程中一个保守的信号通路，涉及多种组织和器官的发50育，包括颅面部的结构，并与胚胎的轴向发育、细胞极性建立以及增殖和分化等多个事件有 关。在脊椎动物中，已经确认了大约 19 个 Wnt 家族成员2。Wnt/-Catenin 通路又被称为 Wnt 经典通路，通过稳定胞内 -Catenin 水平而活化目的基因，由 Wnt1、Wnt3a 和 Wnt8 等 配体激活。当 Wnt 信号与膜受体 FZD 及 LRP5/6 结合形成复合受体后，后者通过一个保守 序列结合并激活由 Dsh 基因家族编码的胞浆蛋白 Dishevelled（Dvl）
10、3，使其过度磷酸化，55抑制了 GSK-3 的磷酸化，使 GSK-3 活性灭活，进而抑制 -Catenin 的降解，保证了 -Catenin 在胞浆内较高的浓度水平。高浓度的 -Catenin 可与胞浆内其他分子，如 N-钙粘蛋白的胞内 部分结合而调节细胞的黏附功能，也可通过核孔转入细胞核与核转录因子，如 T 细胞因子/ 淋巴增强因子家族（T-cell factor/ lymphoid enhancer factor , TCF/ LEF）结合调控特定基因的 转录表达，从而决定细胞的分化、极性、增殖、迁移及癌变等事件。60本研究旨在通过前期基因筛选分析报告，检测筛选出的 Wnt 信号通路中相关
11、基因 GSK-3、Fzd3 和 -TrCP 基因表达水平，并探讨维甲酸诱导腭裂小鼠 Wnt 信号通路的改变 机制。为本课题组日后的骨髓间充质干细胞进行修复重建唇腭裂组织的基础研究提供理论基 础。1材料和方法651.1实验动物选取 10 周龄左右 SPF 级 ICR 小鼠（大连医科大学 SPF 实验动物中心提供），于上午 8 点按照雌雄比例为 2：1 合笼。4 小时后检查阴栓，阴栓阳性的雌鼠记为胚胎 0 天（Embryo Day0，E0）。于 E10 下午 13 点，按照 100 mg/kg 体重对孕鼠进行维甲酸灌胃。对照组孕鼠给予植物油 0.2ml 作为对照。于 E18 脱颈处死孕鼠，剖宫取出
12、胚鼠。以及收集出生 0 天70（postnatal day0，PN0）的幼鼠。1.2实验试剂Prime ScriptRT reagent Kit Perfect Real Time（DRR037A）、SYBRPremix Ex TaqTM （DRR081A）及引物合成购于宝生物（大连）公司。全反式维甲酸购于 Sigma 公司，GSK-3抗体（ab32391）购于 Abcam 公司，Fzd3 抗体（AF1001）购于 R&D 公司，-TrCP 抗体（sc-33213）75购于 Santa Cruz 公司，即用型快捷免疫组化试剂盒（5010）购于 MAIXIN 公司。1.3实时荧光定量 PCR体式
13、显微镜下获取E18胚鼠和PN0幼鼠的腭突组织，采用异硫氰酸胍法（Trizol法）提取总RNA。按PrimeScriptRT reagent Kit反转录试剂盒说明书和SYBRPremix Ex TaqTM 说明书分别进行反转录和实时荧光定量PCR反应。引物序列见表1。80表 1 SYBR Green I Real-time PCR 引物序列及反应条件Tab. 1 Primers of GSK-3, Fzd3 and -TrCP used in quantitative real- time PCR arraysPrimerAccession No.Sequence(5-3)Product(bp
14、)Tm-cyclesGSK-3NM_019827GGCTGTGTGTTGGCTGAATTGTGTTGAAGAGTGCAGGTGTGTCT35460-35Fzd3-TrCP-actinNM_021458AF_112979NM_007393.3TGGGTTGGAAGCAAAAAGAC CCTGCTTTGCTTCTTTGGTC CCAACTGACATCACCCTC AGCCTGTCTCTGTACTGC CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAACATGGAGCCACCGATCCACA23919717160-3560-3560-351.4免疫组织化学收集 PN0 期幼鼠头部，经 4%多聚甲醛固定
15、，石蜡包埋切片制备 4m 厚度的连续组织切85片。常规脱蜡水化后，3过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，组织抗原水浴修复（0.01M 的 枸橼酸缓冲液，pH=6.0）15min。羊血清封闭非特异性抗原，滴加一抗工作液（GSK-3：1:350、 Fzd31：20、-TrCP1：150），4过夜。加二抗。DAB 显色，苏木复染，常规封片。1.5统计学分析采用比较模版阈值循环数（CT 值）相对定量法检测各个样本中 GSK-3、Fzd3 和 -TrCP90的基因表达，-actin 为内参。Real-time PCR 数据分析采用双Ct 值法4。利用 SPSS17.0 软 件对数据进行统计学分析，采用秩和检验
16、方法比较组间表达差异，以 P0.05 水平表示差异 具有显著的统计学意义。2结果2.1正常腭突及维甲酸诱导腭裂中 GSK-3、Fzd3 和 -TrCP mRNA 表达水平952.1.1正常腭突及维甲酸诱导腭裂中 GSK-3 mRNA 表达水平GSK-3 在出生前后均有表达，PN0 期表达高于 E18 期，其中 RA 组具有显著的统计学 差异（P0.05）。E18 期，RA 组的表达稍低于 WT 组， 无显著性差异（P 0.05）；在 PN0 期，RA 组表达水平高于 WT 组，具有统计学差异（P0.05）（Fig 1）。100105110115图 1 出生前后 GSK-3 在正常腭突及 RA
17、诱导腭裂中的表达 (*，与对照组比 P0.05)Fig. 1 Expression of GSK-3 in wild type palatogenesis (WT) and RA-induced cleft palate (RA) during peinatal stage (* P0.05 vs WT group)2.1.2正常腭突及维甲酸诱导腭裂中 Fzd3 mRNA 表达水平Fzd3 在出生前后均有表达，PN0 期表达均高于 E18，其中 RA 组具有显著的统计学差异（P0.05）。E18 期，RA 组的表达水平稍高于 WT 组， 无显著性差异（P 0.05）；在 PN0 期，RA 组表
18、达水平显著高于 WT 组，具有统计学差异（P0.05)， WT 组显著性差异（P0.05）。E18 期，RA 组的表达低于 WT 组，具有统计学差异（P 0.05）；在 PN0 期，RA组表达水平高于 WT 组，具有统计学差异（P0.05）（Fig 3）。120125130图 3 出生前后 -Trcp 在正常腭突及 RA 诱导腭裂中的表达(* 与对照组比 P0.05)Fig. 3 Expression of -Trcp in wild type palatogenesis (WT) and RA-induced cleft palate (RA) during peinatal stage (
19、* P0.05 vs WT group)2.2PN0 期 GSK-3、Fzd3、-TrCP 在腭组织中的表达部位GSK-3 蛋白在正常对照组中主要表达在口腔侧腭上皮细胞，胞浆呈棕黄色阳性染色； 在实验组中表达在口腔侧上皮细胞，集中在口腔侧的腭正中嵴上皮细胞中，在间充质细胞中 也有散在表达，胞浆染色阳性（Fig4A&B）。Fzd3 蛋白分布在正常组表达在腭突上皮中， 在间充质中无表达，而实验组腭突上皮表达水平较高（Fig4C&D）。-TrCP 蛋白在正常组 的腭突口腔侧上皮细胞表达，在间充质细胞中也有散在表达，在成骨细胞中呈强表达；而实 验组中 -TrCP 蛋白表达在口腔侧及鼻腔侧的上皮细胞及相
20、邻间充质细胞中，尤其是集中表 达在腭正中嵴上皮（MEE）及相邻间充质中（Fig4E&F）（Fig 4）。图 4 GSK-3, Fzd3 和 -TrCP 在 PN0 期腭组织中的表达 (标尺：10m)(A) GSK-3 表达在 WT 组的腭上皮。(B) GSK-3 表达在 RA 组的腭上皮。 (C) Fzd3 表达在 WT 组的腭上 皮。(D) Fzd3 表达在 WT 组的腭上皮。(E) -TrCP 表达在 WT 组的腭上皮和间质。(F)：-TrCP 表达在 WT135组的腭上皮和间质。Fig. 4 The distribution of GSK-3, Fzd3 and -TrCP in pal
21、ate at PN0 after birth (Bar: 10m)(A) GSK-3 was detected in the cytoplasm of palatal epithelium in WT group. (B) GSK-3 was detected in RA-induced cleft palatal epitheliume. (C) Fzd3 was detected only in the wild type palatal epithelium. (D) Fzd3 was detected intensely in the RA-induced cleft palatal
22、epithelium. (E) & (F) -TrCP was detected in both ofepithelium and mesenchyme of WT and RA groups.1401451501551601651703讨论腭发育是一个复杂的过程，涉及多种生长因子、细胞外基质、细胞表面受体的调节作用， 这些作用的任何异常都可能导致腭组织不能正常融合从而形成腭裂发生。对调控胚胎期腭突 表达的基因的研究在近年来取得很大进展，但多数基因在腭发育后期及出生中的时空表达变 化及相互影响尚不清楚。Wnt 家族介导不同的细胞内信号转导通路调节不同的发育过程，与胚胎的轴向发育、细 胞极性建立
23、以及细胞命运决定等多个事件有关。GSK3 是一种广泛表达在真核生物中的丝 氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在 Wnt/-catenin 信号传导通路中为负调节因子5。Liu 等6在 2007 年报道 GSK-3 纯合子基因敲除小鼠发生腭裂、肋骨不完全融合以及胸骨分裂表型。He 等 通过条件性敲除 GSK-3 小鼠证明 GSK-3 是正常腭突发生发育的必需基因并且特异性表达 在腭正中嵴上皮中，在腭板上抬时发挥重要的作用。这些结果证实 GSK-3 在腭突发育中是 细胞正常分化及上皮细胞存活的必需因子7。本实验中，虽然 PN0 期的 WT 组和 RA 组 GSK-3 呈高表达水平，但是 RA 组远高于 WT
24、组，免疫组化结果显示出生后维甲酸诱导腭 裂的腭上皮中的 Wnt 通路抑制因子 GSK-3 的表达水平被上调，提示维甲酸可能通过调控 GSK-3 而对 Wnt 信号通路具有抑制作用。在果蝇里，-TrCP 对 Wnt 信号转导通路起抑制作用，并且 Slimb 基因敲除时，Wnt 基 因过度表达。-TrCP 对 Wnt 信号通路的这种抑制作用具有高度保守的特点。-TrCP 在果蝇 中对于 Wnt 信号转导通路中的下游基因起水解作用，并在不同组织呈现特异表达。已有研 究证明 Slimb/-TrCP 在牙胚细胞中超表达后，引起 wnt、ptch1、ptch2 表达减低。同时， Slimb/-TrCP 超
25、表达后，分别引起牙釉上皮细胞、牙间充质细胞的增殖能力减弱8。目前 -TrCP 在腭发育中及腭裂中的作用尚未见相关报道。结合本实验结果，认为 -TrCP 在腭发 育及出生前后中表达，限定了 Wnt 信号转导通路的范围。在出生前 E18 天，-TrCP 在正常 组中呈较高表达水平，提示 -TrCP 在腭发育中至出生前发挥着维持 Wnt 正常的信号转导通 路的作用，也为正常发育提供精确的调节作用。而在出生后 PN0 期，-TrCP 在实验组的表 达显著高于正常组（P0.05）； 实验组中 Fzd3 PN0 的表达水平高于 E18（P0.05），提示维甲酸在出生后上调 Fzd3 在腭的 表达水平即上调
26、了 Wnt 非经典通路又间接抑制 Wnt 经典通路的活性。本研究旨在探讨维甲酸诱导腭裂小鼠出生前后 Wnt 通路信号分子的 mRNA 在正常腭及 维甲酸诱导腭裂的表达变化，及出生后正常腭及维甲酸诱导腭裂的蛋白表达部位。然而，在 维甲酸诱导腭裂发生出生后的新生小鼠中，维甲酸是通过什么机制上调了 GSK-3、-TrCP 及 Fzd3 三者的 mRNA 的表达水平？Fzd3 在腭的时空变化时参与 Wnt 通路中的哪些通路？ 是否是特异性地作用于某个 Wnt 蛋白，而这三个信号分子之间是否存在相互协同作用等问 题都使 Wnt 通路显得更加复杂。对于 Wnt 通路中相关信号分子在成体组织及胚胎发育中的
27、作用机制的研究更加明朗化将对未来的干细胞进行组织修复先天缺损疾病成为可能。4结论本研究结果表明在出生后维甲酸诱导腭裂小鼠腭上皮中 GSK-3, Fzd3 和 -TrCP 等 Wnt 通路抑制因子表达水平上调，提示了维甲酸可能通过调控上述基因而对 Wnt 信号分子通路 的活化具有抑制作用。参考文献 (References)1 Wang R, Cong W, Huang HT and Xiao J. Expression of wnt signaling pathway components in RA-induced cleft palate mouseJ. J Hard Tissue Biol
28、, 2005, 14: 241-242.2 Grigoryan T, Wend P, Klaus A,Birchmeier W.Deciphering the function of canonical Wnt signals in development and disease: conditional loss- and gain-of-function mutations of beta-catenin in miceJ. Genes &Development, 2008, 22(17): 2308-2341.3 Wu D and Pan W. GSK3: A multifaceted
29、kinase in Wnt signalingJ. Trends Biochem Sci, 2010, 35: 161-168. 4 Livak KJ and Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR andthe 2(-Delta Delta C (T) MethodJ. Methods, 2001, 25: 402-408.5 Ciaraldi TP, Oh DK, Christiansen L,Nikoulina SE, Kong APS, Baxi
30、S,Mudaliar S, Henry RR. Tissue-specicexpression and regulation of GSK-3 in human skeletal muscle and adipose tissueJ. Am J Physiol EndocrinolMetab, 2006, 291: E891-E898.6 Liu KJ, Arron JR, Stankunas K, Crabtree GR and Longaker MT. Chemical rescue of cleft palate and midline defects in conditional GS
31、K-3beta miceJ. Nature, 2007, 446: 79-82.7 He F, Anthony P. Popkie, Wei Xiong, Lu Li. Gsk3 beta Is Required in the Epithelium for Palatal Elevation inMiceJ. Developmental Dynamics, 2010, 239(12): 3235-3246.8 Yen AH and Sharpe PT. Regeneration of teeth using stem cell-based tissue engineeringJ. Expert
32、 Opin BiolTher, 2006, 6: 9-16.9 Deardorff MA, Tan C, Saint-Jeannet JP and Klein PS. A role for frizzled3 in neural crest developmentJ. Development, 2001, 128: 3655-3663.10 Yamamoto A, Nagano T, Takehara S, Hibi M and Aizawa S. Shisa promotes head formation through theinhibition of receptor protein maturation for the caudalizing factors, Wnt and FGFJ. Cell, 2005, 120: 223-35.11 Rodriguez-Gil DJ and Greer CA. Wnt/Frizzled family members mediate olfactory sensory neuron axon extensionJ. J Comp Neurol, 2008, 511: 301-317.
