电针水沟对脑出血大鼠大脑皮质 NPY 调节作用的动.doc

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1、精品论文推荐电针水沟对脑出血大鼠大脑皮质 NPY 调节作用的动态观察1孙国杰，杜艳军，孔立红 湖北中医学院针骨系，武汉（430061） E-mail：sunguojie摘要：目的：观察 NPY 在大脑皮层神经细胞和内皮细胞中的表达，探讨电针水沟对脑出 血大鼠 NPY 调节作用的动态变化。方法：将健康青年 Wistar 大鼠随机分为正常组、假手术 组、模型 3h、24h、72h 组、电针 3h、24h、72h 组，每组各 10 只。采用胶原酶诱发的大 鼠尾壳核出血模型；电针组在诱导大鼠尾壳核出血模型的基础上，用 26 号、1 寸不锈钢毫 针电针“水沟”，接 G6805II 电针治疗仪（空白电极接

2、大鼠耳朵），连续波，频率 120 次min， 强度 1mA，留针 30min。造模麻醉醒后立即针刺 1 次，每隔 24h 再针刺一次，3 天后取材。 根据 Bederson 神经体征评分法进行综合等级评分，并采用免疫组化方法检测 NPY 在大脑皮 层神经元和内皮细胞表达。结果：（1）造模麻醉醒后模型组与电针治疗组的神经缺损体征 综合评分无明显差异（P0.05），且电针治疗组的神经缺损体征略高于模型组。电针治疗组 经电针治疗后，其神经缺损体征综合评分逐时递减，与模型组比较有明显差异(p0.05 或 p0.01),与电针治疗前比较亦有明显差异(p0.01)。（2）正常组与假手术组大鼠大脑皮层神经元

3、和内皮细胞有少量的 NPY 阳性表达；脑出血后 3h 大鼠大脑皮层 NPY 的阳性表达开始增高，24h 呈最高峰，胞浆和突起浓染呈棕褐色，血管内皮细胞细胞质中有棕色颗粒，72h 时 有所下降，与正常组比较均有显著性差异（P0.01）。电针组大鼠大脑皮层神经元和内皮细 胞的 NPY 阳性表达，也于 3h 开始表达，于 24h 表达较高，72h 表达减弱，与模型组比较均 有显著性差异（P0.01），与正常组比较 P0.05。结论：电针水沟穴能有效抑制脑出血后 3h、24h、72h 时大脑皮质神经元和血管内皮细胞 NPY 的表达增强，改善脑出血大鼠的行为体征。 但提示脑出血后不同时间段 NPY 对血

4、管内皮细胞的作用效应机制可能是今后脑出血防治研 究的新问题。关键词：神经肽 Y，脑出血，针刺疗法，水沟近年来，越来越多的临床资料表明血肿扩大及其继发性脑损害才是导致病情加重甚至 死亡的主要原因，脑血管的舒缩功能则直接影响脑出血后血液的循环与调节。目前关于神经 肽 Y(NPY)在脑血管内皮细胞的作用研究较少，本实验将采用免疫组化方法，观察 NPY 在 大脑皮层神经细胞和内皮细胞中的表达，初步探讨电针水沟对脑出血大鼠脑血管神经调节的 动态影响。1 材料与方法1.1 动物与试剂健康青年 Wistar 大鼠（湖北省医学科学研究院实验动物中心提供）80 只，体重 200250g，雌雄各半。查随机数字表，

5、分为正常组（10 只）、生理盐水组（10 只）、模型组（30只）、电针治疗组（30 只）。再依同样的方法将模型组、电针治疗组分别分为 3h、24h、72h，3 小组，每组 10 只。SABC 试剂盒和兔抗大鼠 NPY 单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有 限公司。1.2 动物模型制作采用胶原酶诱发的大鼠尾壳核出血模型1。动物经 6%水合氯醛腹腔麻醉（400mg/kg），1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（20040507004）的资助。- 7 -头顶备皮后将动物固定于脑立体定位仪（WDT-微电极推进器脑立体定位仪，国营西北光学仪器厂）上，正中矢状切开头皮，剥离骨膜，调节门齿托的高度，使动

6、物的前、后囟处于 同一水平。以前囟为坐标原点，向后 1.0mm，向右 4.0mm，确定注射点坐标，用手动微型 钻（直径 1.0mm）在注射点钻透颅骨。用 1ul 的微量注射器吸取 0.8ul 的胶原酶溶液（Sigma， type ，0.5unit/ul），缓慢进针 5.0mm，缓慢注射后留针 2min，缓慢退针，钻孔处填入明胶 海绵止血。缝合皮肤，腹腔注射氨苄青霉素 8 万单位，动物清醒后放回笼内饲养。1.3 治疗方法在诱导大鼠尾壳核出血模型的基础上，用 26 号、1 寸不锈钢毫针电针“水沟”，接 G6805II 电针治疗仪（空白电极接大鼠耳朵），连续波，频率 120 次min，强度 1mA，

7、留针 30min。 造模麻醉醒后立即针刺 1 次（麻醉手术后约 40min 苏醒），每隔 24h 再针刺一次，3 天后取 材。1.4 检测方法1.4.1 根据 Bederson 神经体征评分法进行综合等级评分。0 级：无任何行为异常，无缺 损体征；1 级：左前肢屈曲；2 级：无旋转运动，但对来自右侧推力的抵抗力减弱；3 级： 对来自右侧推力的抵抗力减弱的同时，出现向左侧的旋转运动。1.4.2每组大鼠均用 6水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸经升主动脉依次灌入生理盐水100ml、4预冷的含 4多聚甲醛的 0.01mol/L 磷酸缓冲液（PBS,pH7.4）400ml。灌毕取脑， 取视交叉至乳头体之间长约

8、 5mm 的脑组织，置于 4多聚甲醛溶液过夜后固定，石蜡包埋 切片，片厚 5m。按免疫组化 SABC 法常规步骤操作。每只动物随机选取 2 张非连续切片， 每张切片在出血侧大脑皮层随机采集 5 个视野。光镜下检测以胞浆染成棕色为阳性结果，用 计算机图像分析仪（HPIAS-1000,华中科技大学同济医学院千屏影像公司产），对各组 NPY 阳性神经元进行光密度分析。计数 NPY 阳性血管内皮细胞总数（镜下血管内皮细胞细胞 浆中有棕色颗粒者为阳性）和阴性细胞数，并计算阳性细胞百分率。1.5 统计学处理结果用均数标准差（ X S ）表示，显著性检验用 F 检验，组间比较用 q 检验。所有 数据均输入计

9、算机，运用 SPSS10.0 统计软件。2 结果2.1 电针对尾壳核出血大鼠神经缺损行为体征的治疗作用模型组：共 30 只。（1）造模后 3h 出现 2 级体征 3 只，占 10%；出现 3 级体征 27 只， 占 90%，综合等级评分为 2.900.03（2）造模后 24h 出现 2 级体征 7 只，占 23.3%；出现 3 级体征 23 只，占 76.7%，综合等级评分为 2.770.04。（3）造模后 72h 出现 2 级体征 9 只， 占 30%，出现 3 级体征 21 只，占 70%，综合等级评分为 2.700.06。电针治疗组：共 30 只。（1）造模麻醉醒后出现 2 级体征 2

10、只，占 6.7%，出现 3 级体征28 只，占 93.3%，综合等级评分为 2.930.02。（2）造模后经电针治疗 3h 出现 1 级体征 2 只， 占 6.7%，出现 2 级体征 9 只，占 30%，出现 3 级体征 19 只，占 63.3%，综合等级评分为 2.570.07。（3）造模后经电针治疗 24h 出现 0 级体征 2 只，占 6.7%；出现 1 级体征 9 只，占 30%；出现 2 级体征 16 只，占 53.3%；出现 3 级体征 3 只,占 10%，综合等级评分为 1.670.09。（4）造模后经电针治疗 72h 出现 0 级体征 8 只，占 26.7%；出现 1 级体征

11、14 只，占 46.7%；出 现 2 级体征 7 只，占 23.3%；出现 3 级体征 1 只，占 3.3%，综合等级评分为 1.030.03。组别（n） 模型组（n=30） 电针组（n=30）表 1 各组神经缺损体征评分（XSE）table 1 the grade of nerve missing sign in each group造模醒后3h24h72h2.900.032.900.032.770.042.700.062.930.022.570.071.670.091.030.03与模型组比较 P0.01 P0.05 P0.05与治疗前比较 P0.0132.521.51模型组 电针组0.5

12、0造模醒后3h24h72h图 1 模型组、电针治疗组不同时期神经缺损体征综合评分fig1 the grade of nerve missing sign in each group表 1、图 1 显示，造模麻醉醒后模型组与电针治疗组的神经缺损体征综合评分无明显 差异（P0.05），且电针治疗组的神经缺损体征略高于模型组。电针治疗组经电针治疗后， 其神经缺损体征综合评分逐时递减，与模型组比较有明显差异(p0.05 或 p0.01),与电针治疗 前比较亦有明显差异(p0.01)。2.2 各组大鼠大脑皮质 NPY 免疫阳性细胞的表达（见表 2-3，图 2）表 2 各组大鼠大脑皮质 NPY 阳性反应的

13、平均光密度值table 2 the OD value of NPY neurons on cortex in each group组别（group）例数(number)3h24h72h正常组100.11350.0413(natureal group)假手术组100.10660.0314(control group)模型组100.26030.03670.39010.06340.20940.0442(model group)电针组100.17080.04120.16800.04210.16490.0535(EA group)与正常组比较 P0.01 P0.05与模型组比较 P0.01表 3 各组大

14、鼠大脑皮质血管内皮细胞 NPY 阳性细胞率(%)table 3 the positive rate of NPYs expression in endotheliam of cerebral blood vessels组别（group）例数(number)3h24h72h正常组1011.241.18(natureal group)假手术组1012.861.06(control group)模型组1021.193.1133.654.2719.412.38(model group)电针组1014. 972.2315.442.2314. 692.42 (EA group)与正常组比较 P0.01 P

15、0.05与模型组比较 P0.01正常组假手术组模型 3h 组电针 3h 组模型 24h 组电针 24h 组模型 72h 组电针 72h 组图 2 各组大脑皮层的 NPY 阳性神经元表达（200）Fig 2 the expression of NPY neurons on cortex in each group从表 2-3、图 2 中可见，正常组与假手术组大鼠大脑皮质神经元和内皮细胞有少量的 NPY 阳性表达；脑出血后 3h 大鼠大脑皮质 NPY 的阳性表达开始增高，24h 呈最高峰，胞 浆和突起浓染呈棕褐色，血管内皮细胞细胞质中有棕色颗粒，72h 时有所下降，与正常组比 较均有显著性差异（P

16、0.01）。电针组大鼠大脑皮质神经元和内皮细胞的 NPY 阳性表达，也 于 3h 开始表达，于 24h 表达较高，72h 表达减弱，与模型组比较均有显著性差异（P0.01）， 与正常组比较 P0.05。3. 讨论脑出血是发病率、死亡率及致残率都很高的急性脑血管疾病，近几年随着 CT、正电子 发射断层扫描(PET)和弥散加权成像(DWI)的运用，血肿扩大和缺血半暗带再次成为脑出血病理研究的热点2，认为脑出血后血肿扩大和局部脑血流(rCBF)下降造成缺血、缺氧是早期 神经功能恶化的重要原因之一。Warach3更结合患者的神经功能恶化和转归进行细致的研究分析后，认为局部脑血流（rCBF）下降者发生神

17、经功能恶化和预后不良的比率远高于 rCBF无变化者。因而脑血管调节机制在脑出血后脑循环发生一系列改变中具有重要作用。 神经肽 Y 是脑内含量最高的发挥神经递质和血管调节活性作用的多肽4-5，具有强烈收缩脑血管和降低脑血流的效应。主要分布在大脑皮质、丘脑和脑干。向大鼠颈内动脉注射NPY 可使脑血流下降 40%-98%6；临床发现脑出血患者血浆 NPY 浓度显著升高，且随病情 好转而降低7。目前认为神经肽 Y 的增高势必引起血管收缩,进一步升高血压，持续出血及 扩大血肿，并加重周围组织缺血缺氧8。前期我们观察了针刺水沟对急性不完全脑缺血大鼠脑底动脉神经肽 Y 的密度影响，结 果发现脑血管的 NPY

18、 能神经参与了针刺水沟增加脑血流的效应。本实验显示正常组与假手 术组大鼠大脑皮质神经元有少量的 NPY 阳性表达；脑出血后 3h 大鼠大脑皮质 NPY 的阳性 表达开始增高，24h 呈最高峰，胞浆和突起浓染呈棕褐色，血管内皮细胞细胞质中有棕色颗 粒，72h 时有所下降，但依然可见细胞轴突与纤维呈棕褐色，与正常组比较均有显著性差异。 电针水沟则能有效抑制大脑皮质神经元 NPY 的增强，此与电针能降低凝血酶的活性、抑制 炎性反应及改善血液流变性等机制有关。本实验同时发现脑出血的大鼠内皮细胞也有 NPY 的阳性表达，且伴随时间而发生变化。 目前关于脑血管内皮细胞介导 NPY 作用的研究较少。Bao

19、L9研究发现内皮细胞上存在较多 的神经肽 Y1 受体。认为 NPY 可通过对内皮细胞的作用，产生血管活性物质10，增强或减 弱其他递质对血管的刺激作用，从而影响血管的生成11及脑血流。更有学者认为 NPY 通过 减少细胞内 cAMP 的含量,以调制内皮细胞对大分子渗透性,而具有有内皮屏障功能12。实 验通过电针水沟可降低脑出血后 3h 血管内皮细胞胞质的 NPY 表达，但并未随着时间呈现明 显的降低趋势，3h、24h、72h 时间段内皮细胞 NPY 的表达无显著性差异，其机制所在还不 清楚。综上，脑出血后 NPY 对脑血管的调节作用是多方面的。NPY 的收缩血管功能与 NPY 对血管内皮细胞的

20、作用效应之间是何关系？脑出血后不同时间段 NPY 对血管内皮细胞的作 用效应是否存在不同，是今后值得进一步研究的问题。参考文献1Rosenberg GA,Mun-bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke,1990,21(5):801-8072唐宇平，蔡定芳.急性脑出血损伤的病理生理学机制.国外医学脑血管疾病分册,2005,13(1):11-153Warach S. Editorial commentIs there a perihematomal ischemic

21、 penumbra? More questions and an overlooked clue. Stroke,2003,34:1680-16834Chen SH, Cheung RT. Neuropeptide Y and its receptor analogs differentially modulate the immunoreactivity for neuronal or endothelial nitric oxide synthase in the rat brain following focal ischemia with reperfusion. JBiomed Sc

22、i, 2005,12:267-2785路长林，主编.神经肽基础与临床.上海:第二军医大学出版社，2003.128,188,4496Chen SH, Cheung RT. Intracerebroventricular injection of a neuropeptide Y receptor agonist increases while BIBP3226, a Y1 antagonist, reduces the infarct volume following transient middle cerebral artery occlusion in rats. Neuroscience

23、,2003,116:119-1267南光贤，崔明姬，王利平，等.脑血管病患者血浆神经肽 Y 和神经降压素浓度的测定及意义研究.中风与神经疾病杂志，2005，22（2）：160-1628郑吾最，郑声浩，林群力，等.高血压脑出血患者血肿中 NPY 和 CGRP 对继续出血及脑水肿的影响， 中风与神经疾病杂志，2001，18（3）：162-1639Bao L , Kopp J, Zhang X et al. Localization of neuropep tide Y Y1 recep tors in cerebral blood vessels J.Proc Natl A cad Sci USA

24、 , 1997; 94 23 : 12661- 12666.10 Prieto D, Simonsen U , N yborg NC. Regional involvement of an endothelium -derived contractile factor in thevasoactiveactionsofneuropeptideYinbovineisolatedretinalarteriesJ.BrJPharmacol,1995;1166:2729-2737.11 Zukow ska-Grojec Z, Karwatow ska-Prokopczuk E, Rose W et a

25、l. Neuropeptide Y: A novel angiogenic factor from the sympathetic nerves and endothelium J. Circ Res, 1998;83(2):187- 195.12 Noll T, Hempel A,Piper HM. N europeptide Y reduces macro-molecule permeability of coronary endothelial monolayers J.Am J Physiol, 1996;271（5Pt2）:H 1878- H 1883.the dynamic exp

26、ression of neuropeptide Y in brain on electroacupuncture “ShuiGou”Sun Guojie，Du Yanjun，Kong Lihonghubei college of TCM，Wuhan（430061）AbstractObjective: To investigate the dynamic expression of neuropeptide Y in brain cortex and endotheliam ofintercerebral hemorrhage rats, and explore the effects and

27、the possible mechanism of electroacupuncture “ShuiGou”point in regulating brain vascular. Methods: 80 Wistar rats were divided into 4 groups at random: normal group, physiological saline group, model group, and electroacupuncture group. The latter two groups were respectively divided into 3 groups b

28、y different hours: 3h, 24h, and 72h.Rat models of intercerebral hemorrhage were induced by injecting 0.8ulcollagenase , which is behind front-fontane 1.0mm, right 4.0mm, deep 5.0mm. and theelectroacupuncture group rats were stimulated on “Shuigou”point by G6805-II cural apparatus, choosing continune

29、 wave with frequency 120times/min, intension 1mA,remaining 30min. Brain tissue were taken after 3h, 12h, 24h, 48h and 72h, ,and the expression of NPY were detected with the immunohistochemical method. Results:(1) electroacupuncture could improve significantly the nerve missing sign of rats with caud

30、al-putamen hemorrhage (P0.01)(2) As compared with the natural group, the positive reaction labeled NPY were obviously expressed(P0.01) in 3h, 24h, 72h,which is the high point in 24h., positive expression on cortex and endotheliam of cerebral blood vessels were strongly dyed by thick yellow. In elctr

31、oacupuncture group, the positive immunoreaction labeled NPY sparsely distributed, and the average density was obviously reduced as compared with model group(P0.01), but the degressive trend only among 3h, 24h, 72h were no difference.Conclusion: Electroacupuncture on “Shuigou”point can restaining the

32、 overexpression of NPY to reduce its shrinking-vascular action, but it is important that the effect of NPY is how to play on the endotheliam of cerebral blood vessels.Keywords：intercerebral hemorrhage；neuropeptide Y；electroacupunture； “Shuigou”point作者简介：杜艳军（1975-），女，讲师，博士；孙国杰（1938-），教授，博士生导师，主要从事针灸防治脑病的研究，通讯作者。