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1、第十二章 荧光分析法,概 述,某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。,荧光的分类,根据物质是分子还是原子：分子荧光 原子荧光 根据照射光的种类：紫外荧光 X射线荧光 红外荧光,方法测定灵敏度 10-1010-12g/ml,第一节 基本原理,一、分子荧光（一）分子荧光的产生1分子的电子能级与激发过程,S0,S1*,T1,S0,V=0,1,2,3,S1*,S2*,Vn,T1*,荧光与磷光产生示意图,2.荧光和磷光产生,振动弛豫 vibrational relexation 内部能量转换 inte
2、rnal conversion 荧光发射 fluorometry 外部能量转换 external conversion体系间跨越 intersystem crossing磷光的产生,（二）激发光谱与发射光谱,光源,单色器,1,单色器,2,检测器,excitation spectrum 横坐标ex，纵坐标 发射光强度,fluorescence spectrum 横坐标em，纵坐标 发射光强度,溶液荧光光谱通常具有如下特征,Stokes shift荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱的镜像关系,斯托克斯位移,=-,荧光光谱的形状与激发波长无关,不管分子激发到s1还是s2，荧光的发生总是从
3、s1开始，荧光光谱的形状是一样的。,荧光强度,(nm),400,300,500,荧光强度,nm,250,350,V=0,S0,S1*,蒽的激发光谱和发射光谱,荧光光谱的形状与激发波长无关,除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e的时间,二、荧光与分子结构,（一）荧光寿命和荧光效率 fluorescence lift time，f Ft=F0e-Kt 当t=f 时，Ft=（1/e）F0（1/e）F0=F0e-K f 即（1/e）=e-K f Kf=1 K=1/f,Ft=F0 e-t/f,求荧光寿命,Ft=F0 e-t/f,t,直线斜率为,fluorescence efficiency(
4、fluorescence quantum yield),f=,（二）有机化合物分子结构与荧光的关系,长共轭结构分子的刚性取代基,1.长共轭结构,对于芳香族化合物，共轭越长，ex和em都长移，荧光效率也提高。,ex=205nm em=278nm,ex=286nm em=321nm,ex=356nm em=404nm,f=0.11,f=0.36,f=0.29,长共轭的脂肪烃也有荧光,2.分子的刚性,同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性和共平面性越大，越大，长移。,f=0.2,f=1.0,刚性和共平面性增加 电子的共轭程度增加,荧光素钠,酚酞,原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉,Mg,原来共平面性较好
5、的,1-二甲氨基萘-7-磺酸盐,1-二甲氨基萘-8-磺酸盐,取代基的影响,供电子基团-NH2、-OH、-OCH3吸电子基团-COOH、-NO2、-NHCOCH3-R、-SO3H、-NH3+,使,使,影响较小,（三）荧光试剂,荧光胺Dansyl-Cl邻苯二甲醛(OPA)测定无机离子的荧光试剂,荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应,-NH2,R-NH2,ex 275,490nm em 480nm,Dansyl-Cl 与伯仲胺及酚羟基反应,+RNH2,无水丙酮,+HCl,ex 365nm em 500nm,邻苯二甲醛(OPA)与伯胺反应,+RNH2+HSCH2CH2OH,+2H2O,ex 340nm em
6、 455nm,无机离子一般本身没有荧光，但与一些有机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光,+Li+,ex 370nm em 580nm,P235 表12-1,有些无机阴离子可使荧光熄灭,+Al,+CN-,使荧光熄灭或减弱,F-,三、影响荧光强度的外部因素,极性溶剂使K带吸收长移，跃迁几率增大，荧光波长长移，强度增加。溶剂粘度降低，荧光强度减弱。,溶剂,温度 温度升高 荧光效率下降,pH值的影响,pH2无荧光,pH13无荧光,pH712 兰色荧光,pH6.4 无荧光,pH6.4 兰色荧光,荧光熄灭剂的影响,荧光熄灭剂quenching medium,发生碰撞而使之失去能量生成不发光的配位化合物溴、碘
7、以及溶解氧的存在，实现体系间跨越，转变成三线态。,荧光熄灭法fluordscence quenching method,荧光自熄灭,C 1 g/l,散射光的干扰,scattering light,光子与物质分子碰撞,弹性碰撞,非弹性碰撞,碰撞双方能量不变光子运动方向改变,碰撞过程中发生能量传递，同时光子运动方向发生改变,Reyleigh scattering light,Raman scattering light,硫酸奎宁在不同ex的荧光与散射光谱,F,nm,320,448,360,400,ex 320nm,Reyleigh 320nm,Raman 360nm,em 448nm,ex 350
8、nm,Reyleigh 350nm,Raman 400nm,em 448nm,对测定无影响,对测定有影响,在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长,I,F,第三节 定量分析方法,一、荧光强度与物质浓度的关系,F=K(I0-I),I=I010-ECL,F=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL),e-2.3ECL=1+,F=KI0(1-10-ECL)=KI0(1-e-2.3ECL),若C很小，ECl 0.05 则F=2.3KI0ECl=KC,+,F=2.3KI0ECl=KC,ECl0.05 F C ECl 0.05 F 与C不成正比荧光法 紫外法,F,A=-lgT=-lgI/I0
9、,荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法,二、定量分析方法,标准曲线法比例法多组分分析,C1 C2 C3 C4 C5,100%,20,60,80,40,80%,16,48,64,32,用空白溶液调零用标准溶液调满刻度,比例法（对比法）,若在某浓度范围中成线性，可用比例法测定,Cs,Cx,Fs,Fx,=,多组分分析,各组分荧光峰不重叠，可分别测定相互重叠，可利用荧光强度的加和性，如：,Fa=KaCa+KbCb,1:,Fa=Ka Ca+KbCb,2:,第四节 仪器与荧光分析新技术,光源,单色器,样品池,检测器,单色器,放大器,显示器,滤光片荧光计滤光片单色器荧光分光光度计,仪器的校正,灵敏度波
10、长激发光谱和荧光光谱,荧光分析新技术简介,1.激光荧光分析 以激光作光源，谱线更纯、强度更大。可提高灵敏度和专一性。一次测量所需样品液 1g，可测至10-14 10-16g。,新技术,仪器方面更新化学方法改善,2.时间分辨荧光 time-resolved fluorometry,样品,杂质,脉冲激光,10-10 s,10-12 s,3.同步荧光分析 synchronous fluorometry,若：=em-ex,F=K（ex）（em）C,Fex,Fem,F=K（ex）（ex+）C,f,=f C,F=K（em-）（em）C,K,=K C,荧光黄、罗丹明6G、罗丹明B混合物的同步荧光光谱（=3nm）,F,荧光黄,罗丹明6G,罗丹明B,4.胶束增敏荧光,CH3(CH2)11OSO3-Na+,非极性疏水基团,极性亲水基团,增加溶解度增加荧光效率增加荧光的稳定性,
