仪器校验基础知识巩固培训.ppt

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1、Quality&Satisfy,深圳德信诚经济咨询有限公司,公司地址：东莞市长安镇长安图书馆左侧电梯四楼 邮政编码:523850联系人：马小姐 qq：1425983954http：/E-MAIL：,仪器校验,验证,一个提供高准确度的程序，需有文件记录来说明，可保证系统按照预设技术要求前后一致地运行。验证周期的不同阶段 编制计划 建立方法与实施 日常使用与运行支持 淘汰,验证计划,验证计划汇集了系统实现的各项作业验证计划一般包括：项目目标与范围 系统描述 验证方法 作用与责任 项目期限与分步目标 限制调价 相关信息的参考资料,仪器实现状态,分析体系的验证：开发与确认,采购前考虑要点,确定系统要求

2、 理解需求（必须有还是有了更好）基于客户要求的系统评价 供应商 名声、可靠性、质量体系 软件开发生命周期(SDLC)FDA计算机规范（21CFR Part 11）的符合性 硬件与软件功能性需要时进行供应商审计,用户要求1,用户要求确定用户要求系统执行的任务 是用户的愿望列表 在用户要求中不需要提供设计方案用户要求为功能规格提供框架,功能规格,功能规格描述满足用户要求所需要的系统功能、操作模式与环境功能规格包括：硬件与软件要求：每个组元的功能与操作范围 操作环境与地点要求 系统的物理大小 健康与安全 机械：稳定的运转,功能规格,功能规格包括：软件要求 计算机操作系统与联网要求 操作模式与安装 管

3、理控制与数据获取(SCADA)数据类型、容量与存档 系统安全性与21 CFR Part 11 要求 系统接口 用户接口:GUI 与其它系统的接口：通讯与控制 系统恢复,功能规格：举例(HPLC),泵 能够传递准确的流速 梯度系统能够传递准确的梯度紫外UV 检测器 线性反应区间0-1吸收单位（AU）波长准确度+2nm自动进样器 进样体积范围5-1000 L 精度 1%RSD（6次反复进样）能够控制温度柱单元 能够维持恒温,设计确认（DQ）,COTS(不用定制的商用型):满足用户要求与功能规格演示完全符合用户要求确定合格范围,购买后:地点准备,设施考虑 仪器的物理大小 环境控制：温度、湿度感应 设

4、施：电源、水、气、排水、通风、网络连接 健康与安全要求买方的场地准备文件,购买后:系统授权,试运转 条件 草案与试验计划 概述报告 系统运转与校准SOP系统维护，校准/性能确认良好的记录保管,验证分析,组件分析 分别校验系统中每个组件的运行与性能 OQ测试整体分析 校验整个系统的运行，系统适应性测试 PQ与OQ测试,验证(IQ,OQ,PQ),建立系统在应用中的功能与可靠性,验证草案,系统、配置与使用的综合介绍.测试记录 系统描述 测试的目的与对象:范围与限度:详细的操作/功能 测试程序:进行测试的详细步骤每个测试都必须有认可的标准偏差与例外的记录,安装验证,安装仪器的程序说明与设计意图相符;并

5、且在适合操作的环境中安装好。安装前或安装时 对照运送清单核对硬件与软件 检查是否有明显的损坏 场地准备检查 健康与安全防备 检验软件与固定在硬件中软件的版本在仪器详细目录中加入系统,安装验证,计算机化系统 计算机 模块 操作系统 配置 接口卡 软件 版本 现行软件包的位置系统的安装位置数据与文档的位置,安装验证,安装后 适当的系统电力 需要的话，应有不间断供电电源 适当的初始化与回归位置 在模块间适当的连接 如果需要的话，进行模块校准 软件(版本确认)开始适当的使用并保持与硬件的兼容性 备份系统设置的关键文件 记录并归档系统的配置与序列号 建立记录簿适当的检查并由管理方签字结束,硬件记录,软件

6、记录,安装验证,参考文件的实用性 场地准备指南 系统操作手册 销售与货运单据 因素试验记录（如果可以的话）符合性证书 软件开发,操作验证,设置程序，使仪器或系统模块在适当环境下的代表性范围内按照操作说明运行检测系统模块的功能软件功能运用 系统安全、审查记录以及数据文档 观测并记录系统对特殊指令的回应 运行一个标准数据设置进行数据处理验证,HPLC典型OQ的试验,泵:流速精确度、梯度精确度检测器:线性,噪音,偏差,波长准确度进样器:重现性,线性与残留柱温箱:温度准确度硬件与软件控制 软件运用 程序标准数据设置 A到D的转换,验证试验/结果,性能验证,程序证明仪器完全符合了设计要求整体试验证明由不

7、同模块组成的系统运行稳定并在说明书的范围内通过期望用途的需要所有的模块组合成整个系统的典型应用来进行认证。,验证数据审查,通过协议中所有试验的结果 审查并批准数据建立仪器文件体系没有符合认可标准的结果 调查产生失误的原因并决定例外是否可以认可 需要的话进行矫正 证明该调查 再测试失败的模块验证概述报告 列出所有工作，试验结果与例外情况,生产使用,验证报告总结验证过程与支持性数据 结论:仪器符合期望用途的使用要求操作SOP,维护SOP与性能验证SOP对系统操作者提供培训常规系统检查 系统操作，维护，服务，校对 系统缺陷 超时间累积的变更以及确认状态的影响 适合操作,变更控制,计划的变更 硬件:主

8、要部件变更 软件:操作系统变更，升级 固定在硬件中的软件:版本变更影响评估完成前的检查与批准执行变更如果需要的话，进行再验证管理人员批准完成变更程序,变更控制(变更后),仪器类别,要求,维护,预防性的维护能够节约时间和金钱使用与服务记录 系统运行记录 简易维修与预防性维护使用跟踪系统:校对相应的日期提示 简易的审核预备 运行趋势,仪器校对与性能验证(PV),c-GMP要求“仪器、设备、测量仪器与记录设备适当时间周期的校准与制定的书面程序（包括详细指南、时间表、准确度与精密度的限度、在超过精确度与/或精密度限度时采取的预防补救措施）一致。不符合制定规范的仪器、设备、测量仪器与记录设备将不能使用。

9、”CFR 联邦法规法案 附件I:实验室管理,S211.160(b)(4)校对与PV之间是有区别的!,性能验证程序,说明程序的作用与责任详细的文件以及有效力的文档跟踪系统状态提供影响评估的信息校准情况 仪器状态 工作人员 操作者与批准者 校准日期与下一次校准的日期,性能验证的频率,需要考虑的因素:仪器的可靠性 使用软件的型号 供应商的介绍好的运行记录可以减少验证的频率,系统适应性,系统适应性证明在分析的时候，系统运行符合特殊的要求系统适应性可能不能显示边际的性能 例如：波长准确度,低灯强度系统适应性是方法特定的,系统淘汰,仪器书夹中或工作记录中记录淘汰原因和实施日期.将所有相关记录，例如仪器书夹

10、或工作记录、软件与手册（如果实验室不再需要的话）存档.确保所有的电子记录都已经存档，并制定程序.断开所有与仪器建立的连接并安排转移.收回或修改所有受影响的SOPs.更新校准程序与详细目录表,仪器使用周期,系统性能测试,紫外-可见光分光光度计,紫外-可见光分光度计,紫外-可见光分光度计,紫外-可见光扫描分光光度计示意图,紫外-可见光分光光度计,二极管阵列紫外-可见光分光度计示意图,性能参数,波长准确度,在吸收光谱或发射光谱中测得的波长与已知波长的偏离影响到定性测定和定量测定,波长准确度(辐射谱线)氘灯和汞灯,氘灯的辐射谱线为486.0 nm,656.1 nm汞灯的辐射谱线为 253.65 nm

11、302.25 nm 313.16 nm 334.15 nm 365.01 nm 404.66 nm 435.84 nm 546.07 nm 576.96 nm 579.07 nmBP和EP要求 紫外光为 1 nm，可见光为 3 nm,波长准确度(辐射谱线)氘灯,氘灯的辐射谱线 486.0 nm 656.1 nm将灯放到入射狭缝前以单束光模式或能量 模式测量将十次测量结果的平 均值与已知的数值进 行比较锐线光谱内置光源,波长准确度汞灯,汞灯的辐射谱线 253.65 nm 302.25 nm 313.16 nm 334.15 nm 365.01 nm 404.66 nm 435.84 nm 546

12、.07 nm 576.96 nm 579.07 nm将灯放在入射狭缝前以单束光模式或能量 模式测量将十次测量结果的平 均值与已知的数值进 行比较锐线光谱涉及到紫外,波长准确度氧化钬和铷镨玻璃滤光镜,氧化钬 270-640nm铷镨玻璃 400-760nmNIST SRMs可获得易使用增宽光谱线限制到可见光范围,波长准确度,氧化钬(Ho2O3)的10%v/v高氯酸溶液(HClO4)活性形式是Ho3+(H2O)n当浓度和温度发生变化时很少形成复合物腐蚀性溶液！小心拿放!NIST SRM 2034(240-640nm)4%氧化钬溶于10%高氯酸 仪器光谱宽度为3nm或更少 室温条件稳定8年 用10mm

13、玻璃小管密封 max 依赖于光谱带宽,波长准确度NIST SRM 2034(240-640nm),峰10是与光谱带宽相关的。,波长准确度,杂散光,任何位于所选择波长的带宽外的波 长的检测光由于散射或更高层次的 衍射产生。杂散光在高吸收值时能导致严重的 误差 吸收值降低 线性偏离 降低可用的范围,杂散光标准,光谱范围 溶液 检测波长 175 200 nm Aq.KCl(12g/l)*200 nm(BP,EP)210 259 nm Aq.NaI(10g/l)220 nm 300 385 nm Aq.NaNO2(50g/l)340 nm使用空气作为参比吸收值:大于2透光率:小于0.01*检测取决于K

14、Cl的纯度，光谱的分辨率和,噪音,来源于光源和电子元件影响到检测限和准确度测试 在吸收度模式下扫描空气 在500nm处记录下峰到峰噪音(p-p)评估RMS噪音 噪音(p-p)x 0.2 噪音 0.0001 Abs.,线性动态范围,可接受的偏离线性的吸收值范围 在高吸收值时由于杂散光受限制 在低吸收值时由于噪音受限制 常规，大约有0.5%误差，范围从0.3到1AU。,稳定性,在I0和I间的检测，由于灯的强度和电路的变化产生漂移 导致检测的系统误差每小时在340nm测量吸收值的变化通常，低于每小时0.0003A,基线平直度,校正输出的能力在吸收度模式下扫描空气 通常不低于0.001 AU,分辨率,

15、影响分辨率的因素 光谱带宽(SBW)和自然带宽(NBW)的比率 SBW 是狭缝的宽度和光栅色散能力的函数 数字取样 更小的取样间隔能增加分辨率,分辨率,分辨率不够降低在最大值的吸收度使用0.02%v/v甲苯环己烷溶液,光度测量准确度,测量的吸收值和建立的标准值的差异使用在确定波长下已知吸收度的滤镜:NIST SRM 930 和SRM 1930 系列玻璃滤光镜(440-635 nm):10%T,20%T,30%T,1%T,3%T,50%T NIST 2301含有金属的石英滤光镜(250-635)SRM 930e 吸收度滤,光度测量准确度,光度测量准确度重铬酸钾溶液,BP和EP:0.006%w/v

16、 重铬酸钾的0.005M H2SO4溶液(60.06 mg/L)NIST 重铬酸钾的0.001N HClO4溶液(0.06g/kg)特定的吸收度A(l%,1 cm)=Abs./cd c=%(w/v)d=光程长度(cm)典型准确度为 0.01 AU,光度测量准确度,0.006%w/v 重铬酸钾硫酸溶液的典型的特定吸收度(0.06g/kg)重铬酸钾的0.001N高氯酸溶液的典型的特定吸收度(NIST),波长(nm)吸收度(AU)A(1%,1cm)允许值(A)235 0.748 124.5 122.9-126.2257 0.865 144 142.4-145.7313 0.292 48.6 47.0

17、-50.3350 0.640 106.6 104.9-108.2,波长(nm)吸收度(AU)A(kg.g-1cm-1)235 0.741 12.347257 0.862 14.374313 0.289 4.816350 0.642 10.692,红外分光光度计,红外光谱学,在红外区域的电磁辐射导致分子中振动能量的变化。典型的波长范围如下：中红外:400-4000 cm-1 近红外:4000-12500 cm-1反映主要的定性信息 官能团，特性，ID,电磁光谱,红外分光光度计,FTIR分光光度计的示意图,性能验证,适用于FTIR(美国材料与试验协会（ASTM）E 1421)ASTM 零级和一级测

18、试,波长准确度,波长的偏差在峰的已知波长的吸收峰 处读取峰的波长数与相应峰的标准波长数相 比较。偏差应为 1.0到1.5 cm-1。,波长准确度IR参比标准,光滑聚苯乙烯膜(0.03 to 0.05 mm)3500 to 500 cm-1(NIST SRM 1921)聚苯乙烯峰波长(cm-1)548 842 906 1028 1069 1154 1583 1601 1943 2850 3001 3026 3060 3082 BP 和EP:1.0 cm-1 1.5 cm-1 JP:1944 cm-1(1 cm-1),2924 cm-1(2 cm-1)其他峰:(0 3 0 5 cm-1),聚苯乙烯

19、波谱,波长重现性,仪器的性能包括在连续检测中在特定波段 处产生相同波长对扫描型仪器更加重要日本药典(JP)1000 cm-1(1 cm-1)处重复测量2次 3000 cm-1(5 cm-1)处重复测量2次,分离度,使用聚苯乙烯膜(0.05 mm)2851cm-1处的最 大值(B)和2870cm-1 处的最小值(A)间的差异不得 小于18%T1583 cm-1 处的 最大值(D)和 1589 cm-1 处的 最小值(C)间的差,杂散光,在低透射率时杂散光会产生误差对定性测量不重要ASTM E932 茚/樟脑/环己酮混合物 特定条件特定波长下的透光率不得超过2%,噪音,在透射率模式下扫描空气记录生

20、产厂商指定波长下（代表性的如 2000 cm-1）峰到峰(p-p)的噪音评估RMS噪音 噪音(p-p)噪音的RMS 0.1%透光率,光度测定重现性,仪器的性能包括在连续检测中得到相同 的光度测定值同一样品测量10次并且计算%RSDJP:两次测量的差异不得超过0.5%,FTIR,ASTM 零级测试 快速测试找出故障或变动 能量谱测试 100%基线测试 聚苯乙烯测试 将测试结果与以前的测试结果相比较典型样品的测试条件应是相似的 选择分辨率为4 cm-1 扫描时间为30秒,FTIRASTM 零级测试,参比波谱图(先前收集)空束波谱(R1)聚苯乙烯的透过率波谱(R2)测试波谱图 空束波谱(S1)在S1

21、后立即收集的空束波谱(S2)聚苯乙烯的透过率波谱(S3),FTIRASTM 零级测试,能量谱测试 S1/R1比值 描绘从95到105%透过率的S1/R1值 报告如下的能量比值 R4000/2000=E4000/E2000 R2000/1000=E2000/E1000能量的降低意味着干涉仪未校正，光源温 度的降低或光路障碍,FTIRASTM 零级测试,100%基线测试 S2/S1比值 描绘从99到101%透过率的S2/S1值 报告分别以4000,2000,1000 和500 cm-1 为中心，范围为100 cm-1 的噪音水平过度的噪音可能是由于干涉仪未校正，光源出现故障或检测器出现故障,FTI

22、RASTM 零级测试,系统性能测试,高效液相HPLC,性能测试:,HPLC模块:泵:流速准确度，递度准确度 检测器:线性，噪音，漂移，波长准确度 进样器:重现性，线性和残留 柱温箱:温度准确性 硬件和软件功能测试,泵,流速准确度 影响保留时间的重现性梯度准确度和线性 影响分离度和保留时间使用脱气甲醇(或1:1的水/甲醇混合物）测量1.0ml/min和2.0ml/min的流速准确 度典型认可:设定流速的 1.0%,泵梯度准确度,溶剂A:甲醇溶剂B:含有示踪剂的甲醇 例如.0.1%丙酮或咖啡因(272nm)梯度图 100%A到100%B 逐步回到100%A 80%B时:B1/H x 100%80%

23、20%B时:B4/H x 100%20%典型认可:平均梯级高度的 1 0%,泵压力测试,用于测试:阀的功能 连接密闭性使用甲醇做为流动 相设定上端压力限度设定流速为1 mL/min堵住泵的出口设定流速为0.1 mL/min 直到压力,HPLC性能检测咖啡因测试,典型的HPLC设置参数:(i)色谱柱:ODS 1,5(ii)流动相:水/乙腈(iii)流速:2.0 mL/分钟(iv)进样体积:10-20 L(v)检测波长:272 nm(vi)柱温:室温,进样器的精密度,精密度 重复进样相同量的样品来测试进样器的性能 与外标标准品定量模式相比较，峰面积或峰 高的精密度和准确度是非常重要的进样器精密度测

24、试 咖啡因用流动相溶解，重复进样6次 记录峰面积的%RSD 和保留时间典型认可:1.0%RSD,进样器的线性,线性 以适当比例不同量的样品测试进样器的性能进样器线性检测 使用流动相制备标准溶液 进不同体积的样品 通常为5到100 L 描绘响应值对进样体积曲线 计算相关系数r典型认可:r 0.999,紫外-可见光检测器线性(ASTM 方法:E685),流动池中加入一系 列不同浓度的标准 溶液浓度范围通常应产 生响应值到2AU描绘响应值（AU）/浓度对log浓度曲 线线性范围:浓度应在RC的5%范围内,进样器残留,残留 清洗进样环和进样后样品的液体通道检测进 样器的性能 影响定量的准确度进样器残留

25、检测 一个样品进样几次后进一次空白样品（只是 溶剂）定量检测空白样品中分析物的量评估残留典型认可:样品峰面积的 1.0%,UV-Vis 检测器的性能,波长准确度 影响灵敏度和选择性 影响杂质分析线性 影响标准品和样品间的峰面积和峰高的准 确度噪音和漂移 检测限和定量限 影响基线检测和峰积分,UV-Vis 检测器波长准确度,内置滤波器或光谱线Built-in filter or spectral line重铬酸钾的0.001N高氯酸溶液氧化钬的0.001N高氯酸溶液高氯酸铒溶液（2g溶于25ml水中）max 为255 nm咖啡因溶液 max 为205nm,272 nm和min 为244 nm典型

26、认可:2 nm,UV-Vis 检测器线性,流动池中加入一系列不同浓度的标准溶 液。对压力波动的敏感度通常浓度范围产生的响应值达到1.5AU描绘响应值对溶液浓度的曲线计算样品浓度和响应值的相关系数典型认可:r 0.999,UV-Vis 检测器噪音,噪音 电子噪音，泵噪音和突起灯亮度偏低，流动池污染严重，温度不稳定 短期噪音 每分钟大于1个循环 长期噪音 每小时6到60个循环漂移 噪音基线的平均斜率 以AU/h来表示（一个小时内的测量结果）典型认可:5 10-4 AU/hr,UV-Vis 检测器噪音,检测的方法(ASTM 方法E685)在测试前系统预热24小时 甲醇脱气，流速为1mL/min 如果

27、可行的话，背压维持在至少500psi 防止系统温度波动 使用空气或氮气做为参比静态测试:无流速(水,254nm)停止流动使系统稳定(1 h)测量短期噪音和长期噪音以及漂移动态测试:溶剂通过流动池 设定流速为1 mL/min,使系统稳定 测量短期噪音和长期噪音以及漂移,UV-Vis 检测器,短期噪音和长期噪音,短期噪音=Yn/n(1min 间隔)长期噪音=Z1(Z1 Z2)n,UV-Vis 检测器漂移,漂移 测量1个小时内检测器的输出 噪音基线的斜率（以AU/h表示）,柱温箱,柱子的温度影响化合物的保留时间 温度增加会降低容量因子k 保留时间缩短柱温箱的精密度和准确度应进行校正。校 正通过流动相

28、流动条件下用校正的温度计 进行。柱温应在设定温度的 3度之间,系统的死体积,系统的死体积可以通过观察峰的扩展情况 来评估。死体积越大导致峰的扩展越大典型的测试条件:流动相:85:15 水/乙腈 流速:0.5 mL/min 检测波长:272 nm 进样量:12.5 g/mL咖啡因溶液10 L峰的扩展(L)=流速(L/min)x 5%的峰宽(min),模数转换,色谱工作站(CDS servers)的模数转换 线性，干扰，精确度和准确度 分辨率 使用峰发生器进行测试,常规认可,学习概述:,陈述URS，FRS和DQ的IQ，OQ，PQ的 关系。对于UV，FRS中应记录下什么?校准和PV之间有什么不同?为

29、什么SST不能代替定期的PV?为什么波长的准确度是重要的?为什么杂散光会影响线性?分辨率如何影响到紫外-可见光的检测?为什么LC检测器的线性检测是必需的,参考文献,USP General Chpater,2006Chapter 9:Analytcial Method Validation and Instrument Performance verification;Chung Chow Chan,Y.C.Lee,Herman Lam and Xue Ming Zhang,Wiley InterScience,2004.ISO/IEC 17025:General requirements fo

30、r the compliance of testing and calibration laboratories,1999Validation and Qualification in Analytical Laboratories Ludwig Huber,Interpharm Press Inc.1999Quality assurance and instrumentation,L.Huber,Accreditation and Quality Assurance,Vol.1,p24,1998Equipment qualification in practice,L.Huber,LC-GC

31、,Feb.,1998Position paper on the qualification of analytical equipment,M.Freeman et.al.Pharmaceutical Technology Europe,40,1995Validation of Computerized Analytical Systems,紫外-可见光分光光度计的参考文献,Chapter 10:Analytcial Method Validation and Instrument Performance verification;Chung Chow Chan,Y.C.Lee,Herman

32、Lam and Xue Ming Zhang,Wiley InterScience,2004.Certification and use of acidic potassium dichromate solution as an ultraviolet absorbance standard-SRM 935,NIST Special publication 260-54Holmium oxide solution wavelength standard from 240-640nm-SRM 2034,NIST Special publication 260-102,1986Glass filt

33、ers as a standard reference material for spectrophotometry-selection,preparation,certification and use of SRM 930 and 1930,NIST Special publication 260-116,1994Fundamentals of Modern UV-Vis Spectroscopy.T.Owen,Hewlett Packard,1996Standard practice for describing and measuring performance of ultravio

34、let,visible,and near-infrared spectrophotometers,Annual book of ASTM standards,Vol.03.06,E257,1997Window Chem:ISO900/GLP/UV/Vis/NIR Validation,HPLC的参考文献,Chapter 9:Analytcial Method Validation and Instrument Performance verification;Chung Chow Chan,Y.C.Lee,Herman Lam and Xue Ming Zhang,Wiley InterSci

35、ence,2004.United State Pharmacopoeia 24 High Pressure Liquid ChromatographyPerformance verification testing of high performance liquid chromatography equipment,Donald Parroitt,LC-GC,Vol.12,No.2,1994,p.135Operation and performance qualification,V.Grisanti and E Zachowski,LC-GC,Vol.20,No.4,2002.p.355P

36、erformance qualification of LC systems,J.W.Dolan,LC-GC,Vol.20,No.9,2002.p.842Standard practice for testing fixed wavelength photometric detectors used in liquid chromatograpgy,Annual book of ASTM standards,Vol.03.06,E685,1997Standard practice for testing variable wavelength photometric detectors use

37、d in liquid chromatograpgy Annual book of ASTM,HPLC参考文献,Performance Verification-A regulatory burden or an analytical tool?:M.Zooubair El Fallah,LC-GC,Vol.17,No.5,1999.p.343A practical guide to HPLC detection,Donald Parriott,Academic Press Inc.,1993Validation of computerized liquid chromatographic s

38、ystems,W.Furman,T,Layoff and R Tetzlaff,J.of AOAC International,Vol.77,No.5,1994,p.1314Column temperature effects in gradient elution,R.G.Wolcott and J.W.Dolan,LC-GC,Vol.16,No.12,1998,p.1080Introduction to modern liquid chromatography,2 Ed.,L.R.Snyder and J.J.Kirkland,John Wiley and Sons,1979The imp

39、ortant of temperature,J.W.Dolan,LC-GC,Vol.20,No.6,2002.p.524UV detector noise,M.D.Nelson and J.W.Dolan,LC-GC,Vol.17,No.1,1999.p.12,参考文献,Standard practice for describing and measuring performance of dispersive infrared spectrometers,Annual book of ASTM standards,Vol.03.06.,E932,1997Standard practice

40、for describing and measuring performance of Fourier Transform infrared(FTIR)spectrometers,Annual book of ASTM standards,Vol.03.06.,E1421,1997Polystyrene films for calibrating the wavelength scale of infrared spectrophotomenters-SRM 1921,NIST Special publication 260-122,1995Brian Smith Fundamental of

41、 Fourier Transform,有用的网站,实验室顺应性:FDA:校准和验证工作组:,方法验证,Herman Lam,博士首席研究员分析技术加拿大葛兰素史克,2006年7月,方法验证,为何需要验证方法?提供证据保证该方法是准确、可靠和可行 的。建立该方法的性能范围c-GMP 要求:CFR 联邦条例法典 S211.165(e)“公司采用的测试方法的精确度、灵敏度、特异性和重复性需要确定并备有相关证明文件”,性能特征,方法的验证是其性能特征的系统性评价 的论证。性能特征通过如下的参数来表 示:专属性 线性 准确度 精密度 范围 检测限 定量限 耐用性,专属性,对那些可能存在的成份（杂质、降解

42、产物、基 质）能够进行准确分析的能力。所有的相关物质和药物活性成份应能相互分 辨出来（稳定性指示方法）不受辅料的干扰（或辅料的降解产物）不受系统峰的干扰（例如离子对试剂）分离度最小 1.2正交试验确证专属性(如果需要的话）LC-MS,专属性,分析样品/空白对照（含有可能干扰测定的显 著水平）。加入可获得的杂质 加速降解或老化的样品 使用二极管阵列建立光谱纯度正交试验确证专属性（如果需要的话）LC-MS,光谱峰纯度,特异性和专属性,能够在一组信号中选出 相要的信号例如：接有紫外-可见光检测 器的HPLC,只对一个特别成份响应例如：接有质谱检测器的?,线性,是样品成比例浓度的分析中获得测试结果 的

43、能力（在给定范围内）考虑到单点校对浓度范围至少等于准确度测量的范围（最 少5个点）。测试：测试浓度的80%到120%CU:测试浓度的70%到130%（除非其他是 合理的）溶出度：指定范围的+/-20%杂质:标准的50到120%。,线性,不同的方法 可靠样品的直接称量 对于低浓度样品不适合 引入称量误差 可以检查出溶解性问题 由贮备液进行系列稀释 适合低浓度样品 清除称量误差 不能检查出溶解性问题,线性,画出分析浓度或柱上样量与响应值的函数 对图谱进样研究 不要强制直线通过零点(使用截距=0的y=mx)报告回归直线的相关系数、斜率、y轴截距 和平方的残数和 认可的检测相关系数 活性成份R 0.9

44、99 杂质R 0.990 截距为初始值的2%以内+偏差:干扰-偏差:分析物遗失,简化的线性作图,线性色谱图50-150%,注:150%时高度为935 mV(必须小于1000mV).100%的活性成份最适宜的高度是650 mV左右,线性图,精密度和准确度,准确度,相对真实值的接近程度 以回收率表示 方法比较 可以由精密度,线性和专属性（只是药物物质）推 断出来。准确度试验受如下条件影响 是否所有的分析物已经溶解了 可提取的和吸收损失 正确的检测 检测器对样品和标准品的响应 被分析物的相对响应值,准确度,回收率:在方法的范围内将已知量的被分析物 加到空白对照或样品中 最小9个检测样品，3 x 3水

45、平，覆盖到范围（通常 为正常的80，100和120%）检测结果与理论值比较确定回收率 通常主峰在98.0到102.0%内 对于杂质，通常如下：0.2%以下+/-0.05%0.2-1.0%相应的+/-20%1.0%以上相应的+/-10%,准确度,方法比较 不需要参比标准品 最小9个测量值，3 x 3的水平，覆盖在范围内 验证方法的结果和参比的已验证的方法的结果做比较 通常主峰在98%和102%之内 通常杂质在90%和110%之内计算相关系数数据不可比？参比方法可能不是最好的方法!LCGC North America Vol.23,No.1,Jan 2005.p46,精密度:测量一致性,在指定条件

46、下，同一个均匀供试品，经 多次取样进行一系列检测所得结果之间 的接近程度。重复性:在较短的时间间隔内在相同操作条 件下的精密度(也称为分析内精密度).中间精密度:表达实验室内条件变动：不同 的日期，不同分析者，不同仪器设备等测定 结果的精密度。重现性：不同实验室之间的精密度(通常使 用方法学的标准化合作研究)。,精密度,重复性:9 个测定结果，3 x 3个浓度 或100%的浓度水平，最少6个测定结果 通常主峰的2%RSD中间精密度:不同的日期，分析者和仪器设备重现性:实验室间试验,范围,检测能够达到一定水平的精密度，准确 度和线性，样品中的被分析高低限水平 的间隔。,范围,ICH 推荐值 含量

47、测定 检测浓度的80到120%CU 检测浓度的70到130%的最小值 溶出度在指定范围的+/-20%例如：第一个小时20%,10个小时后90%,范 围为0到110%杂质 来自质量标准的120%的报告水平,检测限度(LOD),被分析物能够被检测到但是不需要定量测定的最低浓度。依赖于检测器的响应值信噪比为3:1 尖峰信号，漂移，色谱条件比如梯度洗脱 可能影响杂音的检测。尖峰比S/N更高,检测限(LOD),以响应值和斜率的标准偏差为基础:LOD=3.3/S S=校正曲线的斜率=标准偏差点 3 倍 在空白信号以上 1型和2型误差,检测限(LOD),标准偏差表示 空白响应值(接近关注的峰的10倍峰宽区域

48、的1/5 峰 对峰噪音)回归直线的残数,C=x值的和,D 是x的残数检测LOD和LOQ,LCGC North America Vol.16,No.10,October 1998.p922,定量限,LOQ 能够在认可的精密度和准确度条 件下定量测量的被分析物的最低浓度信噪比为10:1以响应值的标准偏差和斜率的比值为基 础：QL=10/S S=校正曲线的斜率=标准偏差 空白响应值或回归直线的残数或回归直线的y轴截距灵敏度：与校正曲线的斜率有关响应值/浓度或被分析物的量,耐用性,耐用性是一种方法参数预设的微小变化 时，不受影响的能力，保证了正常使用 时方法的可靠性。建立了实际的操作限度,耐用性,溶液

49、稳定性（最后稀释）标准溶液和样品溶液 相关情况的+/-1.5%样品提取时间,色谱参数:(LC)标准的范围 检测波长+/-4nm 流动相的pH值+/-0.2 单位 流动相的组成+/-5%前混合与在泵内混合 色谱柱的不同供应商+/-三家 温度+/-5 C 流速+/-2%,耐用性,耐用性,驻留体积=驻留时间x 流速混合器和色谱柱柱头间的体积仪器和仪器间存在差异(0.5 mL to 3 mL)调整初始等度保留的时间长度抵偿驻留体 积的差异、,试验程序,一些试验可以一起进行 例如：精密度和准确度标准的程序:专属性 检测限和定量限 线性 准确度 精密度 耐用性(可以做为开发试验的一部分来完成)在验证试验开

50、始前进行系统适应性试验,验证计划,确定耐用性的重要试验参数方法验证的材料:已知相关物质的可靠样品 重要的药品(用于精密度和专属性)重要的空白对照（用于专属性）用于准确度的空白对照(用于加样试验),方法验证SOPs 和方案,SOP列出关于验证需要的最小量的高水平信息和常规 认可标准。方案列出了进行验证的方法进行验证试验的详细要求 目的和验证范围(预期要求)验证参数 认可的标准（有理由的限度）偏差和修正,验证方案 药品 活性成份,验证方案 药品 活性成份续,验证方案 药品 活性物质续,方法验证报告,验证报告应包括：验证的目的和范围（期望的用途）方法的说明 验证认真试难程 试验结果:图表，图谱，统计