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1、载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题,一、获取目的基因,二、重组,三、转化,反转录法反转录-聚合酶链反应法化学合成法对已发现的基因的改造,载体选择,重组方法,受体细胞的选择,转化方法,方法,四、筛选,五、表达,筛选方法,注意的问题,抗性筛选，蓝白班筛选,是否容易产生抗性突变，是否有假阳性,融合表达,包含体表达,分泌型表达,表达方式,一、获取目的基因,目的基因,来源,用途,（决定载体和受体细胞的选择）,克隆,表达,分泌型表达,融合表达,包含体表达,反转录法反转录-聚合酶链反应法化学合成法对已发现的基因的改造,目的基因提取方法,二、重组,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13噬菌体载体,
2、噬菌粒载体,载体,（一）载体的选择,载体,表达型载体：如pUC18/19，pGEM-T载体,克隆型载体：如pBR322，TA载体,（二）重组方法：用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来,1.克隆基因的酶切位点问题2.载体的酶切问题3.连接片段浓度比的问题,需要考虑的问题：,(1)黏性末端连接；(2)平末端连接；(3)同聚物接尾连接；(4)接头连接法。,三、转化,（一）受体细胞的选择,大肠杆菌,枯草杆菌,链霉菌,酵母菌,昆虫细胞（家蚕）,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,植物细胞（拟南芥菜、烟叶）,常用的受体,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（
3、Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654,酵母菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母,啤酒酵母,重组和转化需要共同注意的问题,目的基因的稳定性，酶切位点载体的酶切位点，选择标记载体的拷贝数，载体和受体的相容性受体的表达系统目的菌对密码子的偏爱,四、筛选,（一）筛选方法,（二）注意事项,(1)遗传学方法(2)物理筛选法(3)核酸杂交法(4)表达产物分析法,1.连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般连接粘性末端酶量的10-100倍。2.在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mgml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-
4、200mgml。3.连接反应后，反应液在0储存数天，-80储存2个月，但是在-20冰冻保存将会降低效率。4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37，在连接粘性末端时，反应温度以10-16为好，平齐末端则以15-20为好。5.在连接反应中，如不对载体进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。6.麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落
5、，当时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-alactosidase)水解后生成的吲哚衍显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的。8.在含有X-gal和IPTG的筛选上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。,五、表达,（一）分泌型表达,目的蛋白稳定性高,目的蛋白易于分离,目的蛋白末端完整,（二）包含体表达,能简化外源基因表达产物的分离操作,能在一定程度上保持表达产物的结构稳定,（三）融合表达,目的蛋白稳定性高,目的蛋白易于分离,目的蛋白表达率高,目的蛋白溶解性好,目的蛋白需要回收,小组成员：沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、周明毅制作：曾宇,谢谢,
