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1、免 疫 组 化Immunohistochemistry,学习本章节的总体要求*1.熟悉免疫组织化学技术特点及其原理*2.掌握免疫组织化学染色的操作流 程*3.熟悉免疫化学反应相关术语及其所用免疫试剂的来源和质量控制 4.了解多克隆抗体制备程序与操作要求 5.了解单克隆抗体制备原理和步骤,概 论 一、什么是免疫组织化学 免疫组织化学是应用免疫学和组织化学原理，对细胞组织标本中的某些多肽、蛋白质等大分子物质进行定性、定位、定量研究的一门科学。,这项技术本质上是一种染色及原位示踪技术，它是在酶组织化学基础上发展起来的，始于20世纪中期。,二、发展历史,免疫荧光标记抗体技术-Coons 1940年免疫
2、酶标抗体技术-Abakane 1963不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术-Sternberger 1970胶体金免疫标记技术和亲和标记技术-Hsu 1985,免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体。,1.特异性强 专一 2.敏感性高 检测阈值达ng或pg水平 3.定位准确 既可定性、定位，又可定量 4.三位一体 形态、功能和代谢三结合 缺点：干扰多，易出现假阳性,三、技术特点（优点）,（一）组织处理与切片选择（二）免疫染色的前处理 试
3、剂准备（示踪，放大，标记）消化 阻断*（三）免疫组化染色 原理、优缺点、流程（四）免疫染色的后处理 增强、衬染、封固,四、免疫组织化学染色操作步骤,*（五）结果判断与对照设置 方法众多 敏感不同 程序雷同 按需选用,关键步骤：特异抗体-桥联抗体-标记抗体种系必需匹配（第一抗体）（第二抗体）（第三抗体）,第一节 抗原和抗体,一、抗原：凡能刺激机体产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内、外发生特异性结合（反应原性）的物质。,抗原的免疫原性取决于抗原的异物性；大分子；表面积；专一决定簇等。,半抗原载体蛋白 全抗原载体蛋白：BSA、多聚赖氨酸、牛甲状腺球蛋白等
4、；（免疫原性强，易获得，交叉反应易去除）交联要求：不改变半抗原的分子构型；远离半抗原的抗原决定簇；高结合率（结合半抗原数目至少20个以上）,交联剂,抗原决定簇(表位)：抗原分子中决定抗原特异性的活性化学基团，其性质、数量、空间构型决定抗原的特异性。-免疫组化的精确性、特异性,交叉反应：抗原（或抗体）除与其相应抗体（或抗原）特异结合外，有时可与其他抗体（或抗原）发生反应。-多数天然抗原表面带有多个相同或不同的表位-不同抗原的表位相同或相似的情况下可发生交叉反应-免疫组化的假阳性,二、抗体,B细胞在抗原刺激下增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，又称免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。-可
5、与相应抗原特异性结合-亦可作为抗原，激发免疫应答,抗体的分子结构 1.抗体分子在立体构型上都是Ig，但 Ig不都是抗体。2.各类Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构,包括二条相同的重链(heavy chain,H链),及二条相同的轻链(light chain,L链),每条重链(H链)和轻链(L链)分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。,3.两条重链间，两条轻链间及重链和轻链间，分别借二硫键连接。此为免疫球蛋白的基本结构，又称为免疫球蛋白的单体,呈“Y”字构型。,4.重链上结合有不同量的糖,故Ig属糖蛋白。根据重链抗原性的不同可分为5类，即 链，链，链，链和链，由它们组成的Ig分别称为IgM，Ig
6、G，IgA，IgE和IgD。,5.轻链也可根据其化学结构和抗原性的差异分为和二型。一个Ig分子的二条轻链型别相同，绝无可能型和型共同存在于同一个Ig分子中。,6.Ig单体的氨基酸序列可分为恒定区（constant region,C区)和可变区（variable region,V区）。-可变区位于Ig多肽链的N端，占轻链的约1/2及重链的约1/4（Ig结合抗原的所在部位）-恒定区位于Ig多肽链的C端，占轻链的余下的1/2及重链的3/4（补体结合域，Fc受体结合位点，Ig 抗原决定簇等所在部位）,7.Ig的水解片断可因选用的水解酶不同而异。采用木瓜蛋白酶(papain)水解Ig时：-2个相同的Fa
7、b(fragment antigen binding)段，即抗原结合片断-1个Fc（fragment crystalliable)段，即可结晶片断，拥有Ig抗原决定簇。,采用胃蛋白酶（pepsin），其酶切位点在Ig重链间二硫键近羧基端-一个具双价抗体活性的F(ab)2片断-一个不具任何免疫活性的Fc片断。,8.抗体的蛋白类型主要为IgG和IgM。-IgM见于初次免疫和免疫早期，滞留时间较短。-IgG一般见于加强免疫和免疫晚期，滞留时间较长，是免疫球蛋白的主要类型。,三、抗体的制备,依制备途径，目前人工制备的特异性抗体有三类：-多克隆抗体（PcAb）-单克隆抗体（McAb）-基因工程抗体,（一
8、）抗原提取与纯化的一般原则1.建立检测方法（定性、定量、活性）2.选择抗原含量高、易获得、价廉、可大量收集的样品为原料-人AFPAFP(+)肝癌病人腹水；46月胎儿血清-鼠AFP孕18天大鼠羊水-波形蛋白（vimentin）猪、牛眼晶状体-角蛋白（keratin）角化上皮-肌红蛋白（myoglobin）骨骼肌-胶原（collagen）皮肤、肌腱等,3.保持抗原分子的稳定性-低温、适度pH与离子强度、抑制酶解、保护巯基 4.操作步骤简易、有效。-提取-分离纯化-浓缩-贮存,（二）多克隆抗体（抗血清）PcAb的 制备程序 多克隆抗体-指由不同克隆B细胞产生的抗体混合物。-每种抗原有多个表位-用其免
9、疫动物会产生针对各表位的不同抗体（多克隆抗体）-血清中的抗体皆是多克隆的 优点：制备简便、价格低廉、抗体效价高缺点：特异性不高、易发交叉反应、效价不太稳定,（二）多克隆抗体（抗血清）PcAb的 制备程序,1 抗原纯化免疫原 2 免疫动物免疫对象 3 收集抗血清粗、混合品 4 提取IgG PcAb，纯品 5 质量鉴定效价、特异性、蛋白量 6 保存与使用免疫试剂 纯度（杂纯）：抗血清r球蛋白IgG特异性IgGIgG片段（Fab或F(ab)2）抗体IgG,（三）单克隆抗体的制备及其应用,单克隆抗体是指由单个克隆的杂交瘤细胞产生针对一种抗原决定簇的特异性抗体。它是采用B淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工
10、程）制备的。,优点：纯度高、特异性强、交叉反应少、质量和效价稳定缺点：制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低,1.利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理-淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个B细胞克隆只产生一种抗体；-细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性；-利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。,2.McAb的制备流程 亲本细胞准备细胞杂交融合（PEG）HAT选择性培养杂交瘤细胞克隆性培养与建株（有效稀释法）大量制备单克隆抗体质量鉴定与分装冻存（扩大培养或接种动物）（杂交瘤细胞冻存与复苏）,抗原免疫 免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞(BALB/C小鼠)（经8-AG或6-TG诱导）(亲本细胞)混合、融合（PEG）选择性培养（HAT）筛选和克隆化 冻存 阳性细胞建株（稳定分泌McAb）（杂交瘤细胞）复苏 McAb大量制备（上清或腹水-鼠）稳定性检查 纯化、鉴定（特异性、活性、含量）,2.McAb的制备流程,四、抗体的标记,-荧光素-酶-胶体金、胶体铁,
