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1、2006年10月,全国结核病细菌学诊断标准培训,结核病流行和防治策略 端木宏谨 北京结核病胸部肿瘤研究所,与结核病细菌学实验室诊断相关的结核分枝杆菌生物学性状要略 潘毓萱,结核病实验室工作质量保证 姜广路 国家结核病参比实验室,生物安全柜的使用 王秋娣 中国疾病预防控制中心,诊断试验研究与评价 史红 中华检验医学杂志编辑部,结核菌涂片、培养的标准化操作 刘宇红 国家结核病参比实验室,消毒和灭菌 胡继红 卫生部临床检验中心,结核病实验室诊断进展 赵雁林 国家结核病参比实验室,我国结核病防治形势与任务 肖东楼 卫生部疾病预防控制局,全球结核病负担,我国多达5.5亿的人口感染过结核菌,2004年WH
2、O估算,活动性肺结核病1460万人涂阳610万人,新发结核病890万人新涂阳390万人,死于结核病170万人（我国：37万，居法定传染病之首）,结核病控制三大目标：,1.近期目标：到05年，病人发现率达70%，治愈率达85%，DOTS覆盖率达100%,2.中期目标：到2010年，结核病患病率和死亡率在1990年的基础上各下降50%,3.长期目标：到2050年，基本消灭结核病，发病率1/1百万,病人减少百分比=发现率治疗覆盖率完成治疗率治愈率,现代结核病控制策略,政府承诺开展以痰检为主的病人发现工作应用标准短程化疗并实施督导管理建立正规的药物供应系统建立监测系统,结核病控制是由政府提供给大众的卫
3、生服务NTP（national TB control program）,卫生部,国家CDC,国家参比实验室,省卫生厅,地市卫生厅,县卫生局,省CDC（结防所）,地市CDC（结防所）,县结核病防治机构,省参比实验室,地市实验室,县结核病实验室,NTP,我国结核病实验室工作网络的组织管理（疾控）,NTP中主要的实验室工作,涂片镜检简单、快速、最具成本/效益培养比涂片更敏感、特异可以获得培养物药物敏感性试验及鉴定用药参考流行病学评价,抗酸性的基本特性：1.属特异性 富脂质网状胞壁结构 烷基羟基脂肪酸 分枝杆菌分支菌酸 碳链 28 40 棒状杆菌分支菌酸 碳链 40 60 诺卡氏菌分支菌酸 碳链 60
4、 90 2.变异性 培养条件：丙三醇 糖苷 组织内环境 不同菌状态3.抗酸性是分枝杆菌属特异性 不能作为分枝杆菌种水平鉴定的生物学指标,涂片染色镜检相关的生物学性状,传统萋尼氏染色法（1882）Tam Thiam Hok法（1962）1.碱性复红 5 克 1.碱性复红 20 克 酚 25 克 酚 40 克乙醇 95%50 毫升 乙醇 95%100 毫升蒸馏水 500 毫升 蒸馏水 500 毫升 热染 3分钟 冷染 3分钟 2.乙醇 95%970 毫升 2.亚甲兰 5 克 浓盐酸 30 毫升 乙醇 95%150 毫升 蒸馏水 250 毫升 硫酸 96%100 毫升 3.孔雀绿 2.5 克 亚甲兰
5、 2.5 克 苦味酸 3.5 克 蒸馏水 500 毫升,分枝杆菌的形态多样性：BergysMannual of Systematic Bacteriology典型描述：杆状，0.3-0.61-4m,直或稍些弯曲，单个，偶呈串状，染色均匀或不规则，常见异染质，有分枝样生长或集簇倾向,形态多样性：陈旧培养物 淋巴结，干酪组织内呈生理多样性和形态多样性杆菌相（型）：抗酸性+短杆状+-+丝状+/球菌相（型）：诺卡氏菌胞壁缺陷型+/-李斯特菌胞壁缺陷型/-颗粒相（型）：-滤过相（型）：-,细菌学限制：形态多样性和可培养性 抗酸性 镜检阳性依据 分离培养 典型杆状+短杆状+？+球状、丝状+、-？胞壁缺陷
6、部分缺陷-？完全缺陷 L-型-？颗粒/-莫赫颗粒-滤过型-,菌形态多样性 排菌间歇性 痰样本中菌分布不均匀性结果：常规涂片染色镜检是以正常杆菌形态为阳性判定标准出现漏检的假阴性,影响涂片染色镜检的因素 抗酸性的属特异性 假阳性抗酸性变异性 假阴性形态多样性 假阴性均分布不均匀性 假阴性低敏感度 涂阴培阳,结核菌涂片镜检、分离培养标准化操作,1、对象,结核病可疑者咳嗽、咳痰超过3周咳血或伴有血痰发热或胸痛超过2周胸部X线异常确诊并正在接受治疗的结核病人,2、痰标本收集,容器：广口、螺旋盖、可密闭、不易泄漏标本性状：干酪痰、血痰、粘液痰、唾液采集时间：即时痰、晨痰、夜间痰,3、标本接收和登记,检查
7、标本性质，不合格的痰标本可以要求病人重新留取核对申请单和痰盒上的标本信息登记在实验室记录本上,4、材料的准备,痰盒玻片（一端带有磨砂边）竹（木）签定时器染色池、染色架酒精灯加热棒玻片盒废料缸漏斗（滤纸)镊子染色液镜油、镜头纸,5、涂片,编号涂抹痰标本自然干燥,2cm,1 cm,2 vertical lines,1 cm each=100 fields,不得使用火焰加热的方法加速痰膜干燥,太厚 适宜 太薄,痰膜的厚薄,6、染色,萋尼氏热染色法加热固定石炭酸复红初染盐酸酒精脱色美兰复染,非抗酸菌,初染,脱色,复染,抗酸菌,加热固定,将涂片排放在染色架上，注意间隔,滴加碱性复红,滴加碱性复红染色液，
8、铺满玻片*Flooding Slides with Carbol Fuchsin,加热Heating of Slides,流水冲洗Washing the Slide after Carbol Fuchsin,盐酸酒精脱色Decolourizing with Acid Alcohol,流水冲洗脱色液Washing the Slide afterDecolourization with Acid Alcohol,亚甲兰复染Counter staining with Methylene Blue,流水冲洗亚甲兰Washing the Slide after Methylene Blue,沥去玻片上的
9、水，自然干燥Drying the Stained Slides,太厚,太大、不均匀,太大、不均匀、脱色不佳,涂片不佳、不均匀,太小,脱落,脱落,太薄,不均匀、脱落、脱色不佳,7、镜检,在油镜下，至少检查300个（100个）有用的和有代表性的视野（至少5分钟）,荧光染色镜检,FM比ZN镜检法的特异性差 因此 FM 阳性结果应该利用 ZN进行确认FM 方法可以阅读更多的涂片，适用于标本量较多的实验室,8、结果报告,涂片阳性的意义？,涂片阳性说明病人痰标本中含有大量的抗酸菌，是最主要的传染源。,9、玻片的保存,去除镜油保存近期三个月量痰涂片按实验序号存放于玻片盒中，置干燥阴凉处保存,假阴性 假阳性技
10、术错误 涂片 太薄/太厚、暴露在紫外线下 标本中的混杂物质/加热时间过长/使用污染的木签 染色 染色质量不佳、未热染、染色时 结晶/环境抗酸菌、间太短、脱落、涂片未固定 交叉污染 脱色 脱色不佳 脱色不佳 复染 过染 染色不佳镜检员 视力缺陷、仅观察少数视野 经镜油交叉污染读片错误 未经培训 未经培训记录/报告 笔误、标签错误 笔误、标签错误,产生错误结果的因素,分离培养相关的生物学性状,分离培养相关的生物学性状BergysMannual of Systematic Bacteriology倾向蜿蜒索状生长大多数固体培养基上菌落粗糙，突起，致密，常有小结节、褶皱表面和不规则的边缘，常呈白色、暗
11、黄色或黄色，在无表面活性剂液体培养基中静止培养，呈膜生长，随着菌龄增加膜加厚、皱褶；在含Tween液体培养基中震荡培养可分散生长，无扰动机群可分散；试管内代期（generation time)最适条件下 14 15 h可生长温度 30 34，最适生长温度 37 最适pH 6.4 7.05%CO2,0.5%丙三醇 促进早期生长有氧条件下培养物急剧转向无氧条件，菌快速死亡，氧梯度逐步降低，可适应氧饥饿，在液体培养基中可呈同步生长；,营养要求 简单无机合成培养物中可生长 具有合成生长所需要的全部氨基酸、维生素、辅酶因子的基因 Koch时代培养基 凝固血清、马铃薯切块、营养明胶、营养琼脂营养要求研究；
12、快速培养（？）提高检出率现代培养基：强化半合成液体培养基 7H9,11 固体培养基（天然营养物）:罗氏鸡卵培养基 7H 10琼枝培养基,生长缓慢特性-指标 结核 耻垢 大肠-代期(小时)试管 1524 3 0.5 巨嗜细胞 1560 家兔角膜 2022 菌落形成时间（1mm）4 周 数日 隔夜亲脂性胞壁屏障+-核苷酸参入(核苷酸/分钟)3200 快11倍 快 1318倍基因组DNA复制时间(小时)1018 1.81.9 mRNA转录时间(小时)0.12 0.013rRNA操纵子数 1 2 7核糖体数 1700 20,000调控?-,酸性罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基 天门冬素
13、 3.6g 或谷氨酸钠（纯度99%以上）7.2gKH2PO4 14.0gMgSO4.7H2O 0.24g枸橼酸镁 0.6g丙三醇 12ml蒸馏水 600ml新鲜鸡卵液 1000ml2%孔雀绿 20ml,一、培 养 基,原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则：-尽可能杀灭标本中的杂菌-尽可能保存标本中的分枝杆菌,二、标本前处理,操作,痰标本,12倍4%NaOH,振荡匀化,静置,15分钟,37竖直培养8周,均匀接种0.1ml,2支/标本,斜面向上，37水平放置24小时,三、接种和孵育,接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况此后每周观察一次，直至满8周记录
14、菌落生长及污染情况。,四、结果的观察与报告,结核分枝杆菌生长特性：缓慢：在一般培养基上分裂一代需要10多小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。,报 告 方 式分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面,涂阳培阴率过高？,污染率过高？,痰涂片镜检质量保证体系,质量保
15、证(QA）：质量控制（QC）室间质量评估（EQA）现场评价盲法复检批量测试质量提高（QI）,室内质量控制措施,SOP自查试剂的质控（染色液）工作应有详尽记录,室间质量评估(EQA）,与其它实验室比较批量测试和盲法复检结果评价实验室能力。,痰涂片镜检质量保证体系,质量保证体系(QA),质量提高(QI),室间质量评估(EQA),室内质量控制（QC),批量测试,盲法复检,现场评价,为什么要进行EQA,增加人员的责任心推行标准化、规范化操作确保实验室服务质量的提高生物安全的需要加强实验室网络、采集信息,痰涂片镜检EQA 培训的意义,强化EQA的理解，有利于积极推广提高实验室服务质量提高对结核病实验室工
16、作的重视逐步提高结核病防治人员特别是结核病实验室工作人员的地位,控制结核病的五个主要阶段,结核杆菌被发现以前1882年发现结核杆菌1921年采用卡介苗接种1944年链霉素用于抗结核治疗，随后多种抗结核药问世，开始了结核病的化疗时代世界卫生组织（WHO）倡导结核病的短程督导化疗（DOTS）,DOTS策略,一、政府对国家控制结核病规划的政治承诺。二、通过痰涂片显微镜检查发现传染性肺结核病人。三、在直接观察督导下（至少治疗强化期），给予病人免费的标准的短程化疗方案。四、定期不间断地供应抗结核药物。五、建立和维持一个对结核病控制规划（主要是病人发现、登记报告和治疗结核）的监测系统。,病人发现的来源（病
17、人初诊单位）（资料来源：2000年流调）,综合医院：34.1%乡镇卫生院：28.7%私人诊所：22.2%中医院：3.7%结防机构：4.3%,短程化疗的有效性,20世纪7080年代英国WFox教授首创短程化疗研究，先后进行了五次短化研究，设计了26套短程化疗方案，将传统的长程化疗疗程1824个月缩短至69个月。6个月短程化疗方案疗程结束时痰菌阴转率达到97%以上，停止化疗后随访2年细菌学复发率在3%以下。,化疗前后结核杆菌的定量分析,1976年Yeager报告对痰菌阳性病人在化疗前后做结核杆菌培养的定量分析,化疗前每ml细菌数106107,化疗2周后减少至5,化疗4周减少至0.25,化疗后结核杆
18、菌呈对数减少以至消失，降低了传染性,短程化疗的机理,利福平杀菌作用启动速度快，特别是对短暂生长繁殖的半静止菌群的高效杀菌作用吡嗪酰胺对偏酸性环境中（如巨噬细胞内）结核菌的特殊灭菌作用含有利福平和吡嗪酰胺的化疗方案可缩短疗程。这是短程化疗方案之所以能使疗程缩短为6个月的主要根据,细菌学诊断 显微镜检查术 培养免疫学诊断分子生物学诊断 Gen Probe 噬菌体检测方法(FastPlaque)HPLC 其他,结核分枝杆菌的细菌学诊断,培养,on plates or in broth,identification by biochemical or serological tests on pure
19、 growth from single colony,显微镜检查,脱色,复染,染色,unstained or stained with e.g.Gram stain,药敏,血清学,DNA 方法,by disc diffusion methods,breakpoints or MICs,显微镜检查,Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen荧光染色Direct,e.g.auramineImmunofluorescence,培养,Solid mediaAgar platesFor IdentificationFor EnumerationSlopesFor safe long-term cu
20、lture,e.g.Lowenstein-Jensen media for TBLiquid media(broth)For enrichment or maximum sensitivity,菌种鉴定,形态学生长条件生化反应酶抗原分子生物学方法,非培养的诊断方法,血清学检测分子生物学方法其他（HPLC）,噬菌体生物扩增法 将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的抗噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与快速生长的耻垢分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与在含抗结核药物培养基上
21、存活的结核分枝杆菌数有关。,噬菌体法（Fast flaque),噬菌体生物扩增法原理示意图,噬菌体荧光素酶检测法 Jacobs等将荧火虫荧光素酶基因导入分枝杆菌噬菌体，这种噬菌体感染分枝杆菌后，荧光素酶基因被代谢活跃的分枝杆菌活化，在菌细胞内ATP存在的条件下，可产生光子，通过荧光检测器测定发光信号。只有耐药的分枝杆菌才能在含药的培养墓上生长，产生光子，敏感菌和死亡菌不产生或产生后不能维持。,Gen Probe 方法检测结核分枝杆菌,1.原理2.菌种鉴定,RNA/RNA错配法 Nash等(1997)首先将该法用于RFP耐药菌株培养物的检测。该法是基于双链RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的
22、。将待检菌株以及药物敏感的参考菌株(H37Rv)的PCR产物混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通过转录形成两条RNA，在进行杂交，若待检测株为敏感株，则形成两条互补的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待检测菌株有突变发生，则不能与参考株RNA链完全配对，加入RNA酶后，杂交产物将在突变位点被切开，通过电泳即可检测到。,Russia,Brazil,Tokyo,Sweden,Birkhaug,Danish,Prague,Glaxo,Tice,Frappier,Connaught,Phipps,Pasteur,Alpha,Methoxy,Keto,300 bp,200 bp,100 bp
23、,Behr et al.J Bacteriol,2000,Bactec放射呼吸测定 以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢14C软脂酸脱致过程中释放的14CO2的量。该法药敏报告可缩短为4一12天。分枝杆菌生长指示管法 Bactec放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中O2的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。,Bactec呼吸测定,流式细胞仪测定法,原理:分枝杆菌细胞内的非特异性脂酶能水解培养基中加入的荧光素复合物(FDA)为游离的荧光素，因而分枝杆菌在生长过程中可造成荧光素的堆积，经FCM即可
24、检测到。,比色法,MTT法 MTT法为线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成不溶性的Formazan产物,其生成量与活细胞数量成正相关。Formazan经溶解后，可在酶标仪上测定其光吸收值。微孔板美兰比色法 美兰为耗氧指示剂，有氧时为蓝色，无氧时为粉红色。Franzblau等以美兰为指示剂在96孔微量板中培养细菌，培养基中加入抗结核药物，微量板用Parafilm封口膜封闭。若细菌为药物敏感株，可被加入的抗结核药物抑制或杀死，首先表现为氧消耗停止。而耗氧指示剂在各独立微小隔氧环境中的颇色变化可客观反映氧被消耗的程度，从而反映细菌的生长状态。,DNA 测序法,Hirano等应用DNA测序
25、法 DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。利用PCR法扩增待检基因，PCR产物可直接测序，24一48h即可提供精确序列，并准确判定碱基突变的位点，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测。,基因芯片,基因芯片 将耐药基因的DNA或寡核苷酸序列标记到芯片上，从而快速的检测出突变位点，可以在3个小时内完成。,影响结核病控制的因素,DOTS(直接面视下的短程化疗)；全球范围的耐药结核病播散；与HIV的共同感染；流动人口中的结核病；针对结核病新的特异性药物；比BCG有效的新疫苗,耐药结核病,艾滋病和结核病,结核病与流动人口,抗结核药物耐药的发
26、生,由染色体的自发突变而导致对某一种抗结核药耐药的发生频率为10-6到10-8不同药物耐药的突变位点不同，对同时使用的三种抗结核药同时耐药的频率为10-18到10-20联用三种有效的抗结核药物时，发生抗结核药物耐药的机率极少,WHO（2006年）估算,每年MDR-TB新病例30万-60万全球MDR-TB病例100万,我国2000年全国流调结核菌耐药状况,初始耐药：18.6%初始耐多药率：7.6%获得性耐药：46.5%获得性耐多药率：17.1%,异烟肼、链霉素、利福平的耐药率无论在总耐药、初始耐药还是获得性耐药中，均居前3位，乙胺丁醇的耐药率较低。利福平的耐药率有上升趋势，由1984/85年的第
27、5、6位上升到第2、3位。,生长延迟（lag period)-药物 药物浓度 生长延迟(天）g/ml 药物处理 6 h 24 h-异烟肼 1 0 6 9 利福平 0.2 2 3 2 3 链霉素 5 8 10 8 10 乙胺丁醇 10 0 4 5-患者临床株的生长延迟,耐药性产生 自然耐药性和敏感性:种属性 突变耐药性：个体属性1.靶基因突变（基因型）自发,无需药物存在固有频率 高度耐药 种属性、药物属性 频率/菌/代期 突变频率低：INH 2.56 10-8 SM 2.95 10-8 RFP 2.25 10-10 EMB 1 10-7 结核杆菌错配修复限制：硷基选择（亚基）+外切酶校正（亚基）
28、-复制后错配修复-2.药物失活酶 链霉素磷酸化酶 异烟肼乙酰华酶3.质粒耐药:基因型 接触传染-频率高 药物修饰酶4.生理耐药:耐药表型 持留菌的 药物耐受性 敏感基因型,靶编码基因及耐药相关突变-药物 作用机制 参与基因 编码蛋白 突变频率（%）-异烟肼 抑制分支菌酸 inhA 脂肪酸合成酶 21 34 氧自由基 katG 触酶/过氧化物酶 42 58 多效应 kasA 利福平 抑制RNA转录 ropB RNA聚合酶 96 100 吡嗪酰胺 酸化胞浆 pncA 吡嗪酸酶 72 79 脂肪酸合成 fas 脂肪酸合成酶链霉素 抑制蛋白合成 rps L 核糖体蛋白L12 52 59 rrs 16S
29、 rRNA 8 21乙胺丁醇 抑制脂阿拉佰 embCAB 47 65 半乳聚糖 喹诺酮 抑制DNA gyrB B亚基 回旋酶-,艾滋病和结核病,结核病是HIV感染者的首要死亡原因HIV加剧了结核病的流行结核病及HIV/AIDS规划之间的合作不密切,结核病是艾滋病病人最常见的机会性感染，一般约占20-50%艾滋病病人1/3死于结核病,19972004年国内某医院,艾滋病65例中合并真菌感染38例（58.5%）合并结核病23例(35.4%)半年内死亡21例合并结核病者死亡11例（占23例之47.8%）未合并结核病者死亡10例(占42例之23.8%)-中华结核和呼吸杂志2004,Vol.27,No.
30、11,结核病与流动人口,流动人口群体急剧增加,1982年，流动人口总量为三千万，1985年为四千万，1988年为七千万，1994年为八千万，1997年突破一个亿。流动人口数量以平均每年五百万的速度增长，2003年达到一亿五千万。到2020年将再增加3亿人。,流动人口的特点,劳动就业和生活居住问题。流动人口多为青壮年劳动力，近年来流动人口中的女性所占比例逐渐增加，北京市丰台区，1996年流动人口的女性比例是21.8%，2000年达到31.4%；流动人口中家庭化趋势，随着流动人口长期化和相对固定，流动人口中流动户逐渐增加，现约占外来人口总量的30%。流动人口的经济、生活条件差，劳动力数量不断增加，
31、劳动力供给与需求之间形成较大反差。家庭化倾向加重了经济负担，居住和生活条件更加困难。,抗结核病药物的研究前景,传统的药物是针对生长或分化期的结核菌，如细胞壁生物合成、染色体复制等，对慢生长或静息期结核菌的弱作用是需要很长时间治愈结核病的原因 需要新的抗结核药物治疗耐多药结核病,疫 苗,理想疫苗的要求：安全经济；不影响PPD用于诊断；有保护性，能预防结核病的发生，也具有抗结核感染的作用，免疫效应持续时间长并能引起免疫记忆；单次小剂量的应用有保护性；能纳入计划免疫，不干扰其它疫苗的保护性,未来可得的疫苗：修饰的BCG、抑制相关基因的减毒株疫苗、活载体疫苗、死疫苗、亚单位疫苗及DNA疫苗,生物安全柜
32、中国疾病预防控制中心王秋娣,安全设备和个体防护,生物安全柜是最重要的安全设备，是实验室形成最主要的防护屏障之一。必要时实验室应配备其他安全设备。必须给实验室工作人员配备必要的个体防护用品。,生物安全柜,在操作具有感染性的实验材料时：作为一种隔离屏障防止气溶胶的扩散。将在操作过程中产生的气溶胶局限在安全柜内 保护操作者本人实验室环境实验材料。使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的 感染性气溶胶和溅出物而设计的。,个人防护装备,装备包括：1、眼镜（安全镜、护目镜）2、口罩、面罩、防毒面具 3、帽子 4、防护衣(实验服、隔离衣、连体衣、围群)5、手套 6、鞋套 7、听力保护器等。,个体防护的配备原则
33、,BSL1实验室工作人员在实验时应穿工作服，戴防护眼镜。工作人员手上有皮肤破损或皮疹时应戴手套。,个体防护的配备原则,BSL2实验室 除符合BSL1的要求外，还应该符合下列条件：在实验室中应穿着工作服或罩衫等防护服。离开实验室时，防护服必须脱下并留在实验室内。不得穿着外出。用过的工作服应先消毒，然后统一洗涤或丢弃。当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套,如可能发生感染性材料的溢出或溅出，宜戴两副手套。不得戴着手套离开实验室。工作完全结束后方可除去手套。,个体防护的配备原则,一次性手套不得清洗和再次使用。当微生物的操作不可能在生物安全柜内进行，而必须采取外部操作时，为防止感染性材料溅出
34、或雾化危害，必须使用面部保护装置（护目镜、面罩、个体呼吸保护用品或其他防溅出保护设备）。,生物安全柜的定义,主要的保护屏障，防止生物有害气溶胶逃逸.保护操作人员保护周边环境 可以保护样品,Class II 生物安全柜,在生物安全柜上工作,理想的工作台摆放原则（清洁-污染区）在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行,被污染的区域,垃圾袋,干净的物品,废弃物托盘,病原微生物实验室的消毒与灭菌,卫生部临床检验中心胡继红2006.5.,亲脂类病毒或中等大小的病毒（如：HSV,CMV,RSV,HIV,HBV）,细菌繁殖体（如：金葡，绿脓）,真菌（如，念珠菌属，曲霉属）,非脂类或小病毒（如
35、脊髓灰质炎病毒,柯萨奇病毒）,分枝杆菌（如TB，M.terrae）,Cryptosporidium parvum,细菌芽孢,Prions,敏感,耐受,低效,中效,高 效,灭菌（高，延时）,消毒剂水平,气体灭菌,蒸汽灭菌,消毒剂种类（按照标签说明使用）,高效（水平）消毒剂：杀灭所有微生物，除了 大量细菌芽孢。中效：杀灭所有微生物，除了细菌芽孢。低效：杀灭多数细菌繁殖体和脂膜（亲脂性）或 中等大小的病毒。最低有效浓度：液体化学杀菌剂能达到产品标明 能杀灭的微生物范围的活性。,常用化学灭菌剂的性能比较,生物安全柜污染的清除,生物安全柜在移动以及更换过滤器之前，必须清除污染。最常用的方法是采用甲醛蒸气
36、熏蒸。应该由有资质的专业人员来清除生物安全柜的污染。仪器设备在使用时，有些操作可能造成微生物学危害，此外，还必须预测并预防与仪器设备相关的其他安全危害。,诊断试验研究与评价,中华检验医学杂志编辑部 史红E-mail：,内容,诊断试验概述诊断试验的研究方法评价诊断试验的指标诊断试验指标的应用和意义提高诊断试验效率的方法,研究和评价诊断试验的目的,正确认识诊断试验的临床应用价值合理和正确选择诊断试验最终目的提高疾病的诊断水平促进疾病的有效治疗,选择诊断试验的标准,诊断试验的效力（敏感性和特异性）安全性费用可行性结果的重复性病人是否方便和舒适是否能改善患者的结局,诊断试验的研究方法,1.确定金标准,
37、当前医学界公认的诊断某种疾病的最可靠方法包括：外科手术发现病理学诊断（组织活检和尸体解剖）细菌培养影像学诊断临床医学专家共同制订的诊断标准（诊断风湿热的Johes标准）长期临床随访等,2.合理选择研究对象,诊断试验的研究对象包括两组金标准确认的病例组金标准证实无该病的患者，称为对照组诊断试验的临床价值不是取决于是否能区分正常人与重型病例而是取决于能否区分容易混淆的疾病或疾病的严重程度 诊断试验的研究对象不能选择正常人,3.盲法、独立和同步比较诊断试验与金标准的结果,新的诊断试验与金标准盲法比较（Blinding comparison）要求判断诊断试验结果者不能预先知道金标准划分研究对象的结果,
38、将金标准划分的病例组和对照组，以及由诊断试验测试所有研究对象获得的阳性、阴性结果进行同步比较列出四格表，计算相关指标,4.样本含量计算,确定所需的最少样本量诊断试验样本量的大小与下列因素有关：试验的敏感度：用于疾病筛查要求敏感度高试验的特异度：用于疾病确诊要求特异度高允许误差范围：采用敏感度计算病例组样本量、特异度计算对照组样本量,样本含量计算公式,n：为病例组或对照组样本量：正态分布中概率为/2时的值：允许误差，一般为p：敏感度或特异度,1.敏感度（sensitivity）,金标准诊断为“有病”的病例中，诊断试验检测为阳性例数所占的比例真阳性例数愈多，则敏感度愈高，漏诊病例（漏诊率）愈少Se
39、n=a/(a+c),2.特异度（specificity）,金标准诊断为“无病”的病例中，诊断试验检测为阴性例数所占的比例真阴性例数愈多，则特异度愈高，误诊病例（误诊率）愈少Spe=d/(b+d),3.阳性预测值（positive predictive value）,诊断试验检出的全部阳性例数中，真正患病的例数（真阳性）所占的比例+PVa/(a+b),阴性预测值（positive predictive value）,诊断试验检出的全部阴性例数中，真正“无病”的例数（真阴性）所占的比例-PVd/(c+d),提高诊断试验效率的方法,1.选择患病率高的人群,一个诊断试验的敏感度和特异度已固定阳性预测值受患病率影响，呈正相关患病率高的人群，阳性预测值显著提高,2.采用联合试验,同时具有高敏感度和特异度的试验较少可联合使用多个试验诊断某种疾病，提高敏感度或特异度联合试验平行试验（parallel test）序列试验（Serial test）,谢谢大家！,
