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1、实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化,实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。,实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。,技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转 基因鉴定基因功能，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。,实验材料：农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300试剂：YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油。,实验原理：,1.农杆菌简介：第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条
2、件下对单子叶植物也有一定的感染性。,2.双元表达载体系统,双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了TDNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的TDNA的转移。另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在TDNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。,双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。,双元表达载体,双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构,挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB（无抗）液体培养基中
3、，28 200r/mim振荡培养过夜；按1：100的比例接种于50 ml YEB（利福平Rif 125 mg/L）的培养基中扩培，28继续培养至OD600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min；取1.4ml菌液，5,000 rpm，4离心5min，弃上清，将菌体悬浮于1.0 ml（预冷）0.15 mol/L NaCl中。5,000 rpm,4离心5min，弃上清；菌体用120l 预冷的20mmol/L CaCl2（4）轻轻悬浮细胞，之后加80l 50%无菌甘油，无菌甘油的终浓度为20%，液氮中速冻1 min，置-70保存备用或直接用于转化。,农杆菌感受态细胞的制备流程,将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀；冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37水浴5 min；加入1ml（无抗）YEB培养基，28振荡培养4h（选作）；5000 rpm离心3min，弃去部分上清，重新悬浮细胞，涂布于YEB（Kan 100 mg/L 和Rif 125 mg/L）培养基上，28培养2-3d。,农杆菌转化,
