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1、凝胶过滤层析法分离血红蛋白,化学生物学实验,药学院 化学生物学教研室,1.实验目的,初步了解凝胶过滤层析法的简单原理及应用,初步掌握应用凝胶过滤法分离蛋白质,1,2,2.实验原理,层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差别（如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随流动相向前流动而达到分离的目的。层析法可分为多种类型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。,层析法,分配层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,亲和层析,2.实验原理,1,待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相,由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、
2、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同,与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快,分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的,2,3,4,凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形状不同，在通过凝胶（固定相）时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速率慢（阻滞作用大）；而大分子则被排除在外，沿凝胶间空隙随（流动相）流动，流动短而移动速率快（阻滞作用小），比小分子物质先流出层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子筛层析，凝胶过滤法操作简例，且
3、操作条件温和，不易引起生物样品变性失活，分离效果好，故广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离提纯（包括脱盐、浓盐及分子量的测定等）,2.实验原理,本实验通过sephadexG50层析柱，以蒸馏水为流动相，分离血红蛋白（红色，分子量约64,500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白（鱼精蛋白与二硝基氟苯结合后为黄色，分子量为2,000-12,000）的混合物，从颜色的不同即可观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。,2.实验原理,3.实验用品,试剂（1）交联葡聚糖G-50（2）二硝基氟苯（3）鱼精蛋白（4）0.9%NaCl（5）10%碳酸氢钠（6）95%乙醇,仪器（1）锥形瓶（2）层析柱（1cm25cm的玻璃柱
4、）（3）铁架台（4）弹簧夹（5）细橡皮管（长2cm）（6）量筒（7）小烧杯100ml,4.操作步骤,1、凝胶准备：取sephadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水90ml，于沸水浴中煮沸2小时(或放于水中浸泡6小时)，充分膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。2、装柱：关闭下口，向玻璃柱内加入蒸馏水达柱总长度约1/3处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓缓加入柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至1-2cm时，开启柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。再慢慢地继续加入凝胶，直至凝胶体积至柱顶2.5cm左右，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上
5、层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。,4.操作步骤,3、平衡：用10ml左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动表面，是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免气体进入，使柱床干裂。4、加样：待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时(切不可使床面完全暴露于空气中)，关闭下口。用滴管取血红蛋白及鱼精蛋白混合液（血红蛋白稀释液3滴加DNP-鱼精蛋白溶液3滴），十分小心地并缓缓沿内壁加入(注意切勿破坏柱床面)，打开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重新露出时，先加入少量
6、的蒸馏水，冲洗床面1-2次，然后再加入足量蒸馏水。,4.操作步骤,5、洗脱和标定：用试管收集洗脱液体。调节流速使液体均匀流出（约1ml/min），同时记录如下数据：起始、红始、红终、黄始、黄终、终止(1.5倍柱体积)。观察血红蛋白与鱼精蛋白的洗脱次序并记录实验现象(注意洗脱过程中随时添加蒸馏水，以免干柱)。6、清洗：待所有色带流出层析柱后，继续加入蒸馏水并加快流速，清洗层析柱至凝胶洁净呈白色为止。7、凝胶的回收：将清洗干净的sephadex G-50凝胶回收至回收容器中。8、结果处理：观察记录实验现象并加以分析。,5.注意事项,胶膨胀必须彻底，否则会影响层析的均一性，甚至有使柱破裂的危险。装柱
7、前加入1cm洗脱液，检查柱子。凝胶装柱过程中严防出现气泡和分层，要使液面高于床面，以免气体进入柱床，影响液体在柱内的流动与最终血红蛋白及核黄素混合物质的分离效果。凝胶装柱要一次完成。装凝胶的烧杯不能清洗。（看似脏的东西都是凝胶）。柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。加样一定要极其小心而缓慢，以免凝胶被冲起，造成层析结果不佳。上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面(1cm)、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集(13滴/管)。流速不可太快(约10滴/min)。层析前及层析中要绝对避免干柱现象。始终保持柱内液面高于凝胶表面
8、，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。,6.思考题,在向凝胶柱加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？,请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？,某样品中含有1 mg A蛋白（Mr 10,000Da），1 mg B蛋白（Mr 30,000Da），4 mg C蛋白（Mr 60,000Da），1 mg D蛋白（Mr 90,000Da），1 mg E蛋白（Mr 120,000Da），采用Sephadex G75（排阻上下限为3,000-70,000Da）凝胶柱层析，请指出各蛋白的洗脱顺序。,
