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1、第四章 利用基因工程技术表达蛋白质,本章的重点内容：1.什么是基因工程？2.获得目的基因的方法有哪些？3.DNA双脱氧测序技术的基本原理。4.PCR技术的基本原理及其应用。5.基因定点突变技术及其应用。6.表达载体的构建策略与技术方法。7.如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？,第一节 基因工程原理简介,一、基因工程的定义 本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与
2、功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。,目的基因获得,表达载体构建,基因的导入,整合与表达的鉴定,二、基因工程的基本步骤,表达产物的提取、纯化与鉴定,第二节 基因工程中的方法学,一、基因工程的基本技术（一）无菌操作技术（二）核酸的提取纯化 1.RNA提取纯化技术；2.DNA提取纯化技术；3.plasmid提取纯化技术。（三）核酸电泳技术 1.琼脂糖凝胶电泳 2.SDS-PAGE（四）感受态细胞的制备与转化,真核细胞总RNA的电泳结果：,核酸电泳技术 1.琼脂糖凝胶电泳 2.SDS-PAGE,二、一些重要技术原理介
3、绍 重点介绍DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。（一）DNA双脱氧测序,(二)核酸杂交技术（probe）1）原理；2）标记物；3）种类；4）应用,1.Dot blot,2.Southern blot：DNA,3.Northern blot:RNA,Western blot:Protein,（三）PCR技术 1.基本原理 2.引物设计 1)长度;2)GC%;3)stem-loop;4)dimer;5)错配;6)5末端可以不配对 3.应用:科学研究；医学与兽医临床。,Kary B.MullisLa Jolla,CA,USA.B.1944,DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点:
4、1.相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP；半保留复制；均为5 3方向复制。2.不同点：1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为94、52及72 等变温条件；2）参与反应的物质种类和数量不同；3）引物不同，体内为RNA，体外为DNA，且在DNA合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分；4）体内为半不连续合成，体外为连续合成；5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）；8）体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制，体外仅复制两引物 之间的DNA序列。,
5、（四）目的基因的改造技术 1.引物介导的基因定点突变技术 2.盒式突变(cassette mutagenesis)3.Genes Shuffling,三、基因工程中的工具（一）载体 1.质粒(plasmid)2.粘粒(cosmid)3.噬菌体(phage)（二）工具酶 1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶:klenow I 5.核酸酶（三）宿主菌 DH5,JM101,JM109;DE3等,四、获得目的基因的方法 基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控
6、序列的克隆等。,家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析,亚克 隆,Southern Blot,测序,序列分析,技术路线:,结果1:,GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAAT
7、GTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGT
8、ATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCA
9、TATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC,卵黄蛋白基因部分DNA片段特异性探针序列,特异性探针制备,制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1:2000。,结果2:,阳性克隆的筛选和纯化,1#positive clone（about 2000 plaques/plate）Fig.3 Screening result of 1st round in situ hybridization图3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果,YP1,2#positive clone（about 200 plaques/plate）Fig.4 Screening
10、result of 2nd round in situ hybridization图4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果,Numbers：11 positive clone（11 plaques/plate）Fig.5 Screening result of 3rd round in situ hybridization图5 第3次噬菌斑原位杂交筛选结果,获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆,2.0,2.3,4.4,6.6,9.4,23,1.4,1.6,2.0,3.5,4.3,5.0,21,1 2 3 4 5 6,kb,kb,Fig.6 Digestion analysis of recombina
11、nt-DNA of positive plaque图6 阳性克隆-DNA的酶切分析,结果3:,mdYP基因组基因的克隆,1:Lambda DNA/Hind Marker 2:Xho,3:Xho/Hind,4:Hind,5:Sal6:DNA/EcoR+Hind Marker,1:Xho I，2:Hind 3:Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombinant-DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图7 阳性克隆-DNA的 Southern blot,1 ACAGAATTTGCTATTTA
12、GGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAA
13、A 300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATAT
14、TAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700 701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800 801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAA
15、TGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900 901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 10001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001101 CTTATTGAGGAAAAA
16、ATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 12001201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 13001301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCA
17、ATTCT 14001401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 15001501 TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 16001601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTT
18、GAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG 17001701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 18001801 GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC 19001901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTC
19、TCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 20002001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100,获得了全长3991bp的基因组序列，包含1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其5-调控区序列。,2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCA
20、AATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 22002201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATG
21、TTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 25002501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 26002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002701 CTCGTGCCA
22、CACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 28002801 TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA 29002901 ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTT
23、GGCAAAAGAAA 30003001 AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT 31003101 TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA 32003201 AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAG
24、TAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT 33003301 TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG 34003401 AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA 35003501 GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGC
25、ACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT 36003601 TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT 37003701 TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC 38003801
26、 CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC 39003901 TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG 3991图3.卵黄蛋白基因组基因全序列,（二）cDNA文库的构建,家蝇早期胚胎转基因前后的差异表达研究,（三）DD-PCR技术,5-NMAAAAAAAAAAAAAn细胞总RNA或poly(A)R
27、NA,5-NMAAAAAAAAAAAAAn cDNA 3-NMTTTTTTTTTTTT 简并锚定引物,进行PCR,随机十聚体NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT,持续循环,NNNNNNNNNN NMTTTTTTTTTTTT,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,样品A 样品B,作Northern探针,作cDNA文库筛选探针,作亚克隆和测序样品,反转录反应,切取目的带,重新扩增,回收纯化,五、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定1.DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。2.目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下 比例：粘端：35:1；钝端：68:13.转化与重组质粒的筛选、鉴定。1）初步鉴定：
28、抗性；-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR。2）酶切鉴定：大小和方向。3）测序鉴定：双脱氧测序法。,六、基因导入技术（一）细菌 1.氯化钙；2.电穿孔技术。（二）细胞 1.脂质体；2.磷酸钙；3.电穿孔；4.显微注射；5.Virus Vector。（三）受精卵 1.显微注射；2.电穿孔技术；3.精子载体；4.ESC；5.Virus Vector（RT-V or Lentivirus-V）。,七、常用表达系统（一）原核表达系统：包涵体；分泌型。已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。（二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。1.
29、传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等；2.酵母：毕赤（甲醇）酵母。3.生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品重组人抗凝血酶（商品名ATryn）于2006年获准上市。由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业美国Genzyme转基因公司研制成功。,NATURE Biotechnology,October,2000,表1.部分已表达的蛋白质,蛋白/肽 公司 开发现状 治疗疾病,国外公司已开发的部分转基因动物产品Development status of a selected list of proteins produced by tra
30、nsgenic animals,ABX-IL8 mAb Abgenix 临床 I/II 牛皮癣ABX-EGF mAb Abgenix Preclinical EGF-依赖性癌症a-1-抗胰蛋白酶 PPL Therapeutics Phase II 胆囊纤维化a-1蛋白酶抑制剂 Genzyme Transgenics R&D 遗传缺陷-IFN Genzyme Transgenics R&D 多发性硬化胶原 II Pharming Preclinical 风湿性关节炎因子 VII PPL Therapeutics Preclinical 出血时因子 XI PPL Therapeutics Prec
31、linical B型血友病纤维蛋白原 PPL Therapeutics Preclinical 外伤和手术时作组织胶粘剂胰高血素样肽-1 PPL Therapeutics R&D II-型糖尿病人 GH Genzyme Transgenics R&D 身体生长发育，脂肪动员HAS Genzyme Transgenics R&D 血浆膨胀剂和药物赋形剂MSP-1(疟疾苗)Genzyme Transgenics R&D 疟疾蛋白 C PPL Therapeutics Preclinical 防止深部静脉的血栓形成降钙素(salmon)PLL Therapeutics Preclinical 骨质疏
32、松tPA Genzyme Transgenics R&D 心肌梗塞和非栓塞,（三）提高真核表达效率的技术方法,1.选用强启动子，如CMV、EF1等；2.组成型表达（可诱导表达）；3.增强子，如MAR序列；4.poly(A)；5.Dhfr加压筛选系统；6.串联表达；7.稳定表达（瞬时表达）；8.Kozak序列。,基因组序列的选择性扩增染色体扩增,以dhfr基因的扩增为例，说明基因组序列的选择性扩增机制。,二氢喋啶 FH2 FH4 CoF衍生物 合成嘌呤或嘧啶注：（1）合成酶；（2）还原酶。,（1）,（2）,染色体扩增的本质是细胞内特定基因拷贝数的专一性大量扩增(amplification)。（A
33、mplification refers to the production of additional copies of a chromosomal sequence,found as intrachromosomal or extrachromosomal DNA.）,叶 酸,四氢叶酸,Mammalian genes for DHFR(dihydrofolate reductase)have the same relative organization of rather short exons and very long introns,but vary extensively in t
34、he lengths of corresponding introns.,1.类型：Unstable lines and Stable lines,In unstable lines,the amplified genes are at least partially lost when the selective pressure is released,because the amplified genes exist as an extra-chromosomal array.In stable lines,the amplified genes are retained,because
35、 they reside on the chromosome,at the site usually occupied by the single dhfr gene.Usually the other chromosome retains its normal single copy of dhfr.,Figure 17.28 The dhfr gene can be amplified to give unstable copies that are extra-chromosomal(double minutes)or stable(chromosomal).Extra-chromoso
36、mal copies arise at early times.,2.特点 A.在用MTX加压筛选的初期，细胞大部分或全部是不稳定的；B.dhfr基因的单细胞拷贝数的变化范围为40400，随着加压程度的提高，拷贝数逐渐增加（可达1000个），对MTX的耐受力也相应提高；C.dhfr基因的长度为31kb，但被扩增的DNA长度可达5001 000kb；D.当MTX压力解除后，dhfr基因将逐渐减少；E.当与dhfr基因相连的外源DNA导入细胞后，有整合到内源dhfr基因位点的趋势。,3.dhfr加压系统的应用 EPO（促红细胞生成素）的高效表达。,pCMV/EPO,CHO cell line/dh
37、fr-,Stable High Expression,MTX,Transformation,EPO,Extraction,八、整合与表达的鉴定（一）整合鉴定 1.PCR；2.Southern and Dot blot；3.Sequencing（二）表达鉴定 1.RT-PCR and Northern blot 2.RIA 3.SDS-PAGE(Tricine-SDS-PAGE)4.HPLC 5.Western blot（三）蛋白结构鉴定：序列；立体构象。（四）功能检测 活性测定；机体生理生化功能、性状的改变。,九、其他重要技术 如何研究某种生物未知蛋白质的结构与功能？1.首先明确该蛋白的来源：原核或真核生物。2.将该蛋白提取纯化，纯度达97%以上，氨基酸序列测定；或利用该纯化蛋白免疫动物，例如兔子/豚鼠等，制备特异性抗体。3.表达cDNA文库+in situ immunoblot方法。4.RT-PCR法。,如何研究某种已知蛋白的调控序列的结构与功能？,
