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1、毒性机制,中毒,有毒化学物与机体相交作用，导致机体的结构和功能产生不良改变机体本身的属性化学物暴露的程度与途径,毒性机制研究的内容,毒物进入机体的途径毒物与靶分子交互作用毒作用表现机体对损害作用的反应,毒作用机制的复杂性,有毒化学物质数量宠多损害的生物化学过程复杂中毒的表现多种多样可能导致毒性的机制各不相同与靶器官直接作用破坏微环境产生有害影响,几个基本概念,毒效应强度取决于终毒物在其作用位点的浓度和持续时间。,几个基本概念,终毒物指与内源靶分子（如受体、酶、DNA、微丝蛋白、脂质）反应或严重地改变生物学（微）环境、启动结构与（或）功能改变而表现出毒性的物质。,几个基本概念,暴露的母体：强酸强
2、碱、重金属、CO等,CH3,CH3,N-NO,CH3+（亲电子基团）,直接毒性作用,几个基本概念,代谢活化（metabolic activation）增毒（toxication）,对硫磷,对氧磷（高活性胆碱酯酶抑制剂）,常见的增毒作用,最为常见的增毒作用是使外源化学物（如氧和氧化氮）转变为：亲电物（electrophiles）自由基（free radicals）亲核物（mucleophiles）还化还原性反应物（redox-active reductants）,亲电物的形成,亲电物是指含有一个缺电子原子（+）的分子，使它能通过与亲核物中的富电子原子（-）共享电子对而发生反应乙醇乙醛黄曲霉素B1
3、B1-8，9-环氧化物苯并（a）芘BP-7，8-二醇-环氧化物对硫磷对氧磷,亲电物的形成,亲电物是指含有一个缺电子原子（+）的分子，使它能通过与亲核物中的富电子原子（-）共享电子对而发生反应乙醇乙醛黄曲霉素B1B1-8，9-环氧化物苯并（a）芘BP-7，8-二醇-环氧化物对硫磷对氧磷Ag+、Cd2+、Hg2+，等,自由基的形成,独立游离存在的的带有不成对电子的分子、原子或离子。特点产生 清除,顺磁性化学性质十分活泼反应性极高，半减期极短,氧化应激（oxidative stress），进而造成机体损伤,自由基对机体损害作用机制,脂质过氧化损伤细胞器和细胞膜结构破坏引起细胞毒性对DNA的影响（氧化
4、和加合）LDL的氧化修饰,自由基对机体损害作用机制,蛋白质氧化损伤引起蛋白质凝集、交联、降解、断裂，出现生理功能受损组织细胞毒性与坏死免疫反应致癌作用（非突变机理）,主要毒性作用机制,核酸的氧化损伤DNA断裂，缺失突变启动修复系统，如修复功能受损，引起突变活化癌基因细胞毒性改变蛋白质DNA相互作用致突变作用形成活化的癌基因,亲核物的形成,较少见氰化物的形成,苦杏仁经肠道细菌-糖苷酶催化形成氰化物丙烯腈环氧化后与欲胱甘肽结合后形成氰化物硝普钠经巯基诱导降解后形成氰化物二卤甲烷经氧化脱卤产生的CO亚硒酸盐与谷胱甘肽的巯基反应形成的硒化氢,氧化还原活性还原剂的形成,亦较少见硝酸盐亚硝酸盐高铁血红蛋白
5、Cr6+Cr5+,VitC 黄素酶,化学毒物产生毒性的可能途径,化学毒物,吸收、分布、代谢、排汇,与靶分子相互作用,细胞功能失调、损伤,细胞修复功能失调,毒性,（1）,（2）,（3）,化学毒物产生毒性的可能途径,最直接途径毒物在机体的重要部位出现，不与靶分子作用较为复杂途径毒物机体靶部位靶分子毒作用最为复杂的途径毒物机体靶部位靶分子细胞功能结构/功能紊乱启动分子、细胞或组织水平的修复机制毒性作用发生,主要毒性作用机制,化学毒物与细胞大分子的共价结合与蛋白质共价结合：组织细胞毒性与坏死 免疫反应 致癌作用（非突变机理）与核酸分子共价结合：细胞毒性 改变蛋白质DNA相互作用 致突变作用 形成活化的
6、癌基因。,化学毒物的一般毒性作用,概述,外源性化学物的毒性作用,一般毒性作用,致突变作用,致癌作用,发育毒性与致畸作用,急性毒性作用蓄积毒性作用亚慢性和慢性毒性作用,基因突变染色体突变非整倍体和多倍体,概述,靶器官 毒性,血液毒理学免疫毒理学生殖毒理学神经系统和行为毒理学呼吸毒理学肝脏毒理学肾脏毒理学心血管毒理学皮肤毒理学,概述,按接触毒物时间的长短，将产生的一般毒性作用分为：急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性相应地所观察和评价毒效应的试验即为急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验对外来化学物（新食品、药品、农药、化妆品等）一般毒性的观察是毒理学的经常生工作，对防治外源性化学物所致急慢性中毒、
7、毒理学安全性评价和危险度评定、卫生标准制定、管理毒理学的决策有重要意义。,一般毒性作用,1 急性毒性作用 2 蓄积毒性 3 亚慢性和慢性毒性作用 4 局部毒性作用,急性毒性作用,Acute toxicity指机体（实验动物或人）一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内(最长到14天)所产生的毒性效应。包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,急性毒性作用,急性接触次数：一次或24h多次“一次”：经口和经注射途径染毒是指瞬间给予实验动物染毒，经呼吸道与皮肤染毒时，则指在一段规定的时间内使持续接触毒物的过程“多次”：当一次最大染毒剂量不能达到以充分了解该毒物急性毒性作用的目的，从而在2
8、4h内分次染毒。,急性毒性作用,中毒效应出现时间瞬间死亡：氰化钾、煤气等迟发毒效应和死亡：有机磷农药快速和剧烈的毒效应后恢复轻微症状恢复严重中毒死亡（毒菇）714d中毒效应的强度：一般行为、外观、大体形态、中毒症状一般较严重、死亡,急性毒性试验目的,求出致死剂量以及LD50，通过LD50进行毒性分级评价外源性化学物的毒效应特征、靶器官、剂量-反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性。为其它毒理试验研究提供接触剂量和观察指标选择的依据为毒理学机制研究提供线索,急性毒性试验的方法要点,实验动物的选择和要求毒性反应与人近似易于饲养、操作方便繁殖和生育能力强，能保障供给价格低易于获得,急性毒性试验的方
9、法要点,实验动物的物种和品系最好用两种种属的哺乳类动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。大、小鼠符合选择的原则，最常用 SD、Wistar大鼠；昆明种和NIH种小鼠急性经口和毒性吸入试验选择大、小鼠，但经皮试验选择豚鼠、大鼠和家兔,急性毒性试验的方法要点,实验动物的年龄和体重急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。,急性毒性试验的方法要点,性别急性毒性试验的主要内容是求LD50，
10、除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。,急性毒性试验的方法要点,动物数量与随机分组大、小鼠等小动物 每组10只狗等大动物 每组6只分组原则随机化原则,急性毒性试验的方法要点,预检适应环境，减少环境和生理的变化对实验结果的影响筛选健康动物，发现异常者应放弃雌雄分笼饲养，防止交配和受孕,急性毒性试验的方法要点,试验动物的饲养环境恒定的温度：223湿度：3070%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格
11、,急性毒性试验的方法要点,禁食经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、小鼠隔夜禁食；或染毒前禁食4h大动物每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。,受试物处理,受试前了解受试物的理化性质和毒性资料受试物配制水溶液经口用蒸馏水或去离子水，注射用生理盐水；混悬液0.5%羧甲基纤维素钠、10%阿拉伯乳糖、植物油，临用前配制。,受试物处理,给予动物的染毒量不应超出最大给药量容积，减少非特异性因素对毒性的影响经口：20ml/kg.bw 经皮：2ml/kg静脉：1ml/kg（5min以上）肌肉注射：0.5ml/kg（一个部位）吸入：2mg/L,染毒方法,模拟人在生活和生产环境中实际
12、接触该受试物的途径和方法有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较受试物的性质和途径评价程序的要求常见：经口、经呼吸道、经皮及经注射途径。,染毒方法,经口染毒灌胃、喂饲、吞咽胶囊等不同浓度，相同体积准确工作量大误入气管和伤及食管,染毒方法,经呼吸道染毒以气体、蒸气、粉尘、雾等形式存在于车间空气中的工业毒物以及以吸入为给药途径的药物的染毒方式。气管内注入和吸入,静式吸入动式吸入,染毒方法,经皮吸收脱毛局部涂敷受试物玻璃纸覆盖固定一定时间接触染毒观察浸尾法：将动物固定，鼠尾浸入受试物中持续一段时间，观察。,染毒方法,经注射途径染毒对注射用药品的急性毒性试验、毒性机制研究时了解毒物代谢动力静脉、腹腔、肌
13、内、皮下等,剂量选择,化学结构及理化特性查阅文献用少量动物，以较大的剂量间隔（几何级数）染毒，找出1090%（0100%）的致死剂量范围，然后可设计正式试验的剂量和分组。i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1)i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1),根据其它化学物LD50,i 为组矩n 剂量组数,剂量选择,i=(lgLD90-lgLD10)/(n-1)i=(lgLD100-lgLD0)/(n-1)求得i值后，以低剂量组的对数剂量加上一个i值，即是高一个剂量组的对数剂量。其反对数即得出相应的剂量值。,i 为组矩n 剂量组数,剂量选择,化学毒物预试验中5g/kg.bw时，未发现死亡，
14、表示低毒或毒性不大，则一般不需要求出LD50食品或功能食品的LD50的剂量选择以最大的（即无毒剂量LD50为15g/kg.bw）一般要设立对照组。,毒性作用观察,中毒体征及发生过程：不同系统的毒物，急性毒性作用出现的体征不一样，可初步确定受试物的急性毒性的靶器官。死亡情况和时间体重：反映动物中毒后综合性整体变化，是一个客观和简便的量化指标。每周12次病理检查：大体解剖,观察时间和周期,每天2次或多次观察总观察时间一般为14天（2周）速发型死亡：氰化物迟发型死亡：羰基镍、毒菇,急性毒性分级和评价WHO五级标准,急性毒性分级和评价我国农药急性毒性分级,急性毒性分级和评价化学物质性毒性分级,蓄积毒性
15、作用,基本概念,化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。,蓄积毒性作用的基本概念,蓄积作用（accumulation）,外源性化学物,排出体外,机体,直接,代谢物,储存库,血浆蛋白脂肪组织肝脏肾脏骨骼,物质蓄积,功能蓄积,蓄积作用的研究方法,化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性
16、的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。,蓄积系数法,将多次染毒使半数动物出现效应（死亡）的蓄积剂量与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量的比值 K=,ED50（n）,ED 50（1）,LD50（n）,LD 50（1）,蓄积系数法,K值越小，表示化学毒物的蓄积性越大K=1：化学毒在动物体内全部蓄积或每次染毒后毒效应是叠加的。K5：蓄积毒性极弱,蓄积系数-固定剂量法,一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒
17、,先求出LD50，然后选取相同条件的40只动物随机分为两组，一为染毒组，一为对照组，雌雄各半。试验组在120l50LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量LD50(n)，根据公式计算K值，然后进行评价。但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。,蓄积系数-剂量递增法,0.1LD50开始，4天为一期递增1.5倍。在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数
18、不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，即K5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。,蓄积系数-剂量固定的20天蓄积法,分五组，分别是阴性对照，1/20、1/10、1/5、1/2LD50各组均无死亡-蓄积不明显1/2组有死亡，其它组无死亡-弱蓄积性1/20组无死亡，其它各组有死亡且有剂量反应关系-中等蓄积性1/20组有死亡-强蓄积性,生物半减期法,生物半减期(biological half-life，t1/2)法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。,生物半减期法,化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质
19、的速度以及清除速度有关。即使化学毒物以相等的时间间距恒速地吸收入血液，该物质在一定剂量范围内在机体的蓄积量也不呈直线无限地增加，而是呈曲线形上升并有一定的极限。这是因为化学物质吸收进入机体的同时体内也发生着代谢转化及清除的过程。当化学毒物的吸收过程与代谢转化清除的过程达到平衡时，其蓄积量基本上不再增加。,生物半减期法,T 一种化学物以T 相等的时间间矩染毒，其在体内经过6个T 的接触就可以基本上达到蓄积的上限。T 短，达到蓄积极限所需要的时间短T 长，达到蓄积极限所需要的时间长,亚慢性和慢性毒性作用,亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人 或实验动物连续接触较长时间、较大剂
20、量的外源化合物所引起的毒性效应。慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期（甚至终生）反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。,概念,目的,研究受试物亚慢性毒性剂量-反应关系，确定未观察到有害作用的剂量和其观察到有害作用的最低剂量，提出安全限量参考值。观察受试物亚慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官,目的,观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供依据为在其它试验中发现的或未发现的毒作用提供新的信息，比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒性机制和将研究结果外推到人提供依据。,亚慢性毒性试验方法的要点,动物选择品种和品系性别、年龄和动
21、物数：两种性别的离乳动物（大鼠68w）SPF级动物,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（一）实验动物选择,亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验 年龄：大鼠80100g 狗 812月 小鼠1015g数量：小动物20 大动物6性别：雌雄各半,慢性毒性试验年龄：大鼠 5070g 狗 8月 小鼠 初断乳数量：小动物40 大动物8性别：雌雄各半,亚慢性毒性试验方法的要点,染毒方式剂量选择和分组3个剂量组和一个阴性（溶剂）对照组，高-引起明显毒性和少量动物死亡；低-无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（NOAEL），设一个中间剂量组，最好是相当于观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）人拟用剂量的10、30、
22、100倍，组矩以310倍为宜，不低于2倍,亚慢性毒性试验方法的要点,观察指标,外观生长发育行为功能毒性体征,最终体重脏器湿重脏/体比,亚慢性、慢性毒性试验过程,活杀解剖,器官/组织,大体尸解,固定/染色显微镜检查,生物体液血液学血清-化学-生化学尿分析,生物学标志酶内源性成分胆汁尿,脏器系数,亚性毒性作用概念和目的,概念：实验动物或人长期（甚至终身）反复接触外源化学物所产生的毒性效应，长期一般指2年目的研究慢性毒性剂量-反应关系。确定长期接触造成有害作用的最低剂量（LOAEL）或阈剂量和未造成有害作用的剂量（NOEAL），为制定人类接触时的安全限量标准，如最高容许浓度（MAC）和每日容许摄入量
23、（ADI）以及危险度评价提供毒理学依据。,亚性毒性作用概念和目的,观察慢性毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官观察慢性毒作用的可逆性为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据。,慢性毒性试验方法的要点,实验动物：初断乳动物染毒时限：工业毒物一般为6个月，食品和环境毒物为12年分组和剂量：4组，以亚慢性试验的LOAELD确定，1/51/2为高剂量组；1/501/10为中剂量组；1/100为低剂量。或以LD50设计：1/10为高剂量组，1/100为中剂量组，1/1000为低剂量组。观察指标：同亚慢性，组织病理学是非常重要的和必不可少的，最客观最有说服力的指标。,主要毒性作用机制,对生物膜的损害：膜通透性、流动性、和膜表面电荷化学毒物对细胞钙稳态的影响：破坏正常生命活动所需的由第一信使刺激而产生的短暂的钙瞬变，危及细胞器和功能和骨架的结构，最终激活不可逆的细胞分解代谢的过程,主要毒性作用机制,机体内生物大分子的氧化损伤：化学毒物在机体内代谢（主要是氧化还原反应）产生自由基脂质过氧化损伤：细胞器和细胞膜结构破坏 引起细胞毒性 对DNA的影响（氧化和加合）LDL的氧化修饰蛋白质氧化损伤：引起蛋白质凝集、交联、降解、断裂，出现生理功能受损,主要毒性作用机制,核酸的氧化损伤：DNA断裂，缺失突变 启动修复系统，如修复功能受 损，引起突变 活化癌基因,
