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1、叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定,一.实验原理 1.1 叶绿素：主要包括叶绿素a和b分子式:Chla C55H72O5N4Mg Chlb C55H70O6N4Mg结构式:卟啉环化合物 四个吡咯环与四个=CH-组成一个大环,共轭双键形成一个大键,环中央有一个镁原子,卟啉环决定叶绿素颜色,也是吸收可见光,并以诱导共振方式传递光能的根本所在,叶醇尾是由四个异戊二烯单位组成的双萜 Chla 蓝绿色 Chlb 黄绿色 脂溶性:难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有机溶剂 卟啉环头部呈极性,具亲水性;叶醇尾部具亲脂性,皂化反应:Chla、Chlb 是双羧酸的酯 一个羧基被甲基酯化 可发生皂化反应
2、另一个羧基被叶醇基酯化 COOCH3 C32H30ON4Mg+2KOH COOC20H39 COOK C32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OH COOK 取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色,光学特性：,（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640660nm 红光部分 叶绿素特有 410470nm 蓝紫光部分 卟啉环化合物共有（2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒）磷光：Chl溶液停止光照
3、后，仍能在一定时间内放出暗红色的光。寿命长（10-2秒10-3秒）,1.2 类胡萝卜素,类胡萝卜素 胡萝卜素 橙黄色 不溶于水 叶黄素 鲜黄色 溶于有机溶剂分子式、结构式：胡萝卜素：C40H56 有、三种同分异构体 叶黄素是胡萝卜素的衍生物，其两端的紫罗兰酮环第四位C上的H被OH取代，分子式为C40H56O2 类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏,1.3 类黄酮类,根据三碳桥的氧化程度可分为：花色素苷：呈现颜色。紫色锌化物、红色的碱盐、无色化合物 黄酮 防御伤害。存在于花器官和绿叶中。黄酮醇 紫外光保护剂，吸收UV-B，避免细
4、胞受到伤害。异黄酮 功能多样。鱼藤酮杀虫，植物防御素抑制微生物。,花色素苷分布广，溶解于细胞液中，与花、果、叶的颜色有关。颜色受多因素影响：B环上羟基和甲氧基数目 羟基数多，吸收光向长波迁移，颜色偏蓝 羟基被甲氧基替代，吸收光向短波迁移，颜色偏红芳香酸对主要骨架的酯化液泡中pH值 酸红碱蓝营养状况 低温、缺氮、缺磷 促进化色素的形成和积累,不同花色素的取代基和颜色,花色素 3 4 5 颜色花葵素-H-OH-H 橙红 花青素-OH-OH-H 紫红花翠素-OH-OH-OH 蓝紫芍药素-OCH3-OH-H 玫瑰红甲花翠素-OCH3-OH-OH 紫二甲花翠素-OCH3-OH-OCH3 紫红,二.试剂与
5、材料,2.1 实验试剂：石油醚（沸程6090）、丙酮、甲醇、氢氧化钾、石英砂、碳酸镁、氯化钠、醋酸铜。2.2 仪器和器皿：分光光度计、台秤、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管、层析缸 2.3 材料：新鲜菠菜叶片，不同颜色的花和果实。,三.实验操作,丙酮研磨提取叶绿素 过滤、洗研钵及残渣 2mL丙酮提取液 余下的色素提取液用石油醚萃取 加入6N HCl 纸层析 荧光 皂化反应 光破坏（脱镁叶绿素）分离色素 Cu取代 扫描光谱 花色素实验,四.结果与分析,对实验现象作好详细记录，并加以解释请对皂化反应现象做出合理解释，而不是单单用反应方程式来表示,五.注意事项,实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远离火源。研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅。过滤时不要使用滤纸而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松紧适当。叶绿素要避光保存。,六.思考题,6.1 叶绿素、荧光素酶以及绿色荧光蛋白都能产生荧光，它们的原理有什么不同？能量来源有何差异？6.2 转GFP的植物在检测绿色荧光时为何没有看到叶绿素的红色荧光?若选择荧光标记绿色植物细胞,在选择荧光物质时应首先考虑什么问题?6.3 如何判断呈橙黄色的花和果实中含的是类胡萝卜素还是花色素？,
