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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,课题背景,1、尿素的利用:,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因:,CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3,脲酶,3、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,（一）筛选菌株,水生耐热细菌Taq耐高温的Taq DNA聚合酶,选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,启示?,思考：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培
2、养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,3、培养基选择分解尿素的微生物的原理？,1.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,2、显微镜
3、直接计数：,.统计菌落数目：,思考书本22页问题：,说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近
4、真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,计数法,直接计数法、活菌平板计数法、比浊法（原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。）膜过滤法（当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数）,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,实
5、例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,二.实验的具体操作.土壤取样
6、.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养
7、时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,实验设计步骤：1、土壤取样2、制备培养基：3、样品的稀释4、取样涂布5、微生物的培养与观察,微生物的培养与观察,1、结合对照，分析培养物
8、中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？,三.结果分析与评价,对照的培养皿在培养中无菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基，说明选择培养基具有选择作用。,四.课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水
9、用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,例题解析,例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质,解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的
10、生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：A,例2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减
11、少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。,答案：C,3.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别4.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,C,D,5.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主
12、要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。6.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是（）A酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌 B酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌 C酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳酸菌 D黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌,C,测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和
13、104倍稀释，其原因是()A细菌个体小，真菌个体大B细菌易稀释，真菌不易稀释C细菌在土壤中数量比真菌多D随机的，没有原因,C,用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A未接种的选择培养基B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D接种了的选择培养基,C,选C。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，应选牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。,分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐A BC D,
14、C,土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中只加尿素，分解尿素的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培养基；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖作为碳源。,根据实验原理和材料用具，设计实验确定细菌质粒的抗菌素基因所抗的抗菌素的类别。实验原理：作为运载体的质粒带有标记基因，这一标记基因是抗菌素抗性基因，即有抗性基因的质粒可用做运载体。材料用具：青霉素、四环素各10万单位溶液、菌种试管、灭菌的含细菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注射器、无菌水、恒温箱。方法步骤：第一步：分组。_，用三只注射器分别向3个培养基中注入1 mL无菌水_、_，并使之均匀分布在整个培养基表面。第二步：接种。将接种环在_，_接种于三个培养基。第三步：培养。将_。,答案：方法步骤：第一步：取三个含培养基的培养皿，分别编号为1、2、3青霉素液四环素液第二步：酒精灯上灼烧并在酒精灯旁取菌种第三步：接种后的培养基放在37 的恒温箱中培养24小时预期结果及结论：,预期结果及结论：,下课了,
