《培养基及其配制.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《培养基及其配制.ppt（33页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第三章 培养基及其配制,培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,第一节培养基成分及作用,主要成分包括：无机盐类（大量和微量元素）、维生素类、氨基酸类、有机附加物、植物生长调节物质、糖类，水和琼脂等。1.大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素等。(1)N：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等 的组成成分，在制
2、备培养基时以NO3N和NH4N两种 形式供应。(2)P：是磷脂的主要成分。常用的物质有KH2P04或NaH2P04(3)K：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。(4)Mg、S和Ca、Mg：是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H20提供。Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,2.微量元素：指小于0.5mmolL的元素主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，
3、它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA结合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,3.有机化合物碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。维生素：这类化合物主要是以
4、各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.11.0mgL。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,生长培养基是植物再生的必要条件,蔗糖（0%）,蔗糖含量（1%）,蔗糖含量（5%）,外植体完全被绿色的芽所包裹，根生长在其下表面,在外植体上既没有芽发生，也没有根和愈伤组织产生,在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根发生,芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生
5、,tissue culture in the African Violet,(3)肌醇又叫环己六醇：在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度一般为l00mgL，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。氨基酸：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。4.有机附加物：其对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。其成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。常用的有机附加物有:椰乳：香蕉：水解酪蛋白：,5.
6、植物生长调节物植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。5.1生长素类(auxin)：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感，在极低的浓度下，就可促进根生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。一般生长素浓度的使用为0.055mgL。
7、,IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,5
8、.2细胞分裂素类细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin 激动素)、Zt(zeatin 玉米素)等，细胞分裂素0.0510mgL。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。,5.3激素配比模式生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高：有利于根的形成和
9、愈伤组织的形成；适中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成,生长素/细胞分裂素比例,No BAP,BAP reduced to 0.1 mg.l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots.Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg.l-1,More balanced development of roots and shoots.However,undifferentiated callus is developing
10、at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots.Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg.l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface,and few shoots.Some callus,No MS saltsNo sign of
11、regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g.l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g.l-1 Shoots developed on upper surface of explant.No roots or callus.,GA(赤霉素)：有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用
12、，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,6.抗生物质抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。,活性炭的应用：茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，一般为0.1%0.2%，不能超过0.2%。活性炭在生根时有明显的促进作用，可能是通过减弱光 照保护IAA。降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有
13、良好作用，一般浓度为0.3%。,7.活性炭活性炭结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质。,活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性炭放人培养基，会带来不
14、良的后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,、琼脂琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90以上的热水。琼脂条的用量在610gL之间，琼脂粉的用量在34gL之间。若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。,第二节 培养基配制及注意事项,(一)母液配制的目的,方便配置其他培养基；保证各
15、物质成分的准确性及配制时的快速移取,(二)母液配制方法,（一）单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。（二）混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液a ml.,一、培养基母液的配制,（三）母液配制的药品与器材,1、药品：配制MS培养基所需的药品、生长调节物质、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL,2、器材：各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、母液瓶、标签、冰箱等。,（四）母液配制（以MS培养基
16、为例）,有机物母液,铁盐母液,无机大量 母液,无机微量母液,激素母液,配制MS培养基时母液的计算,1、无机大量母液(扩大10倍配1L),成 分,硝酸钾硝酸铵 硫酸镁磷酸二氢钾氯化钙,称量工具,注意：无机大量母液中的各种物质在混合过程中有些离子易产生沉淀，应使每种物质先充分溶解，再进行混合，而且钙盐最后缓慢加入进去。,硼酸，硫酸铜，硫酸锰，硫酸锌，氯化钴，钼酸钠，碘化钾,托盘天平和电子天平,2、无机微量母液（扩大100倍配1000ml）,称量工具,成分,3、铁盐（扩大100倍1000ml）,铁盐,硫酸亚铁，Na2-EDTA,注意：铁盐采用托盘天平称取。铁盐选用硫酸亚铁而不用硫酸铁，是因为它溶解后
17、易产生红色的氢氧化铁沉淀。,4、有机物（扩大50倍500ml）,有机物,甘氨酸VB1VB6烟酸肌醇,注意：有机物中的物质均采用托盘天平和电子天平 称取。,5、激素母液（常用的）,生长素,NAA，IBA，2,4-D，IAA,细胞分裂素,6-BA，KT，GA，ZT,注意：这些激素配制时，一般配成1mg/ml，NAA、IBA、IAA一般可先用少量95%酒精助溶。2，4-D可用0.1molL的NaOH或KOH助溶，细胞分裂素类一般先用少量1molL盐酸溶解。,6、母液的保存,(1)装瓶:将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，在标签上注明母液名称，配制倍数，与配制日期。（2）储藏：母液配好后放人冰箱内4
18、低温保存，用时再按比例稀释。,二、培养基的配制,1、用具器材：粗天平、塑料量杯、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、药勺、PH试纸（）、橡皮吸球、吸水纸、羊皮纸等。,2、药品试剂：蒸馏水、蔗糖、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCL、各种培养基母液,（一）实验用品,（二）培养基配制（以1L百合继代培养基为例）,1、培养基配方：,MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂,2、配方成分计算：,3、配制步骤,混合,溶化琼脂（600-700ml）,母液的量取,加蔗糖,溶解 液,定容（1L）,调PH（5.8）,分装,1.量取前先检查母液并摇动2.量母液前,移液管和量筒应润洗,
