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1、实验七 酵母醇脱氢酶的提纯,1、实验目的,学习和掌握目的物质的提纯掌握酵母醇脱氢酶的提纯方法和原理掌握酵母醇脱氢酶活力测定的方法,2、实验重点和难点,2.1 实验原理2.1 酶活力测定,3、实验原理,酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。,酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质金属离子的作用稳定酶的构象；参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。,NAD+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸,辅酶I 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度；反应为
2、零级反应。酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度(指初速度)可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示.其单位为mol/s。,比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度，即指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯.,抽提 由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。抽提液的具体组
3、成和抽提条件的选择，取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其他物质的连结。选用pH，首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的pH稳定范围。其次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在某些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系，从这点出发，选用pH 46为佳。,盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液,0.15mol/L NaCl等。焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液有助于切断酶和其他物质的联系,也常用.据报道，少数情况
4、下用水抽提亦佳,这可能与低渗破坏细胞结构有关.温度 通常控制在0一4左右.如果酶比较稳定时，可以例外。,抽提液用量 常采用原料量的15倍。有时，为了抽提效果好些需要反复抽提。浓缩 提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1一1。因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如：盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等。这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段。再如真空浓缩、冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。,酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面，根据这些差异.其分离方法可有：(1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、筛膜
5、分离法、凝胶过滤法等。(2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。(5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等.,结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。,盐冰浴的降温原理与溶液的凝固点下降有关。当食盐和冰均匀地混合在一起
6、时，冰因吸收环境热量稍有融化变成水，食盐遇水而溶解，使表面水形成了浓盐溶液。由于浓盐溶液的冰点较纯水低，而此时体系中为浓盐溶液和冰共存，因此体系的温度必须下降才能维持这一共存状态（浓盐溶液和冰的共存温度应该比纯水的冰点更低）。这将导致更多的冰融化变成水来稀释浓盐溶液，在融化过程中因大量吸热而使体系温度降低。,低温冰盐浴配方：(碎冰用量100克)浴温()盐类及用量(克)-4.0 CaCl26H2O(20g)-9.0 CaCl26H2O(41g)-21.5 CaCl26H2O(81g)-40.3 CaCl26H2O(124g)-54.9 CaCl26H2O(143g)-21.3 NaCl(33g)
7、-17.7 NaNO3(50g)-30.0 NH4Cl(20g)+NaCl(40g)-30.6 NH4NO3(32g)+NH4CNS(59g)-30.2 NH4Cl(13g)+NaNO3(37.5g)-34.1 KNO3(2g)+KCNS(112g)-37.4 NH4CNS(39.5g)+NaNO3(54.4g)-40 NH4NO3(42g)+NaCl(42g),酵母醇脱氢酶,醇脱氢酶的辅酶NAD，能催化乙醇脱氢变成乙醛，脱下的氢则使NAD还原。当有过量醇存在时，NAD+被还原的速度与酶活力成正比，酶活力越高，单位时间产生的NADH越多。NADH对340nm紫外线有强吸收，NAD+无此能力，因
8、此可以测定A340nm的方法测得反应体系中NADH含量，从而得知酶活力的大小。,4、操作步骤,1）粗提：20g酵母干粉中加入80mL 0.066M Na2HPO4溶液中37水浴2h，室温放置3h，4000rpm冷冻离心20min;（目的是活化酵母，使其分泌酵母醇脱氢酶，并提取醇脱氢酶到溶液中）2)热变性沉淀杂蛋白：每组取上清液20ml，留取2mL到试管中（冰浴），其余的放置于55水浴20min，迅速冷却；4000rpm冷冻离心20min；（目的是去除热敏感性蛋白质）3）有机溶剂沉淀杂蛋白：取上清液，留取2mL到试管中（冰浴），其余的量体积后，在盐冰浴条件下加入0.5倍体积的冰丙酮，混匀，静止5
9、min，4000rpm冷冻离心20min；（目的去除杂蛋白）,4）有机溶剂沉淀酵母醇脱氢酶：取上清液，留取2mL到试管中（冰浴），其余的量体积后，在盐冰浴条件下逐滴加入0.55倍体积的冰丙酮，沉淀完全后，4000rpm冷冻离心20min；（目的是沉淀酵母醇脱氢酶）5）弃上清，加入5ml水溶解沉淀，置于试管中（冰浴）；6）将每一步获得的溶液进行适当稀释，测定酶活（利用催化醇脱氢的方法）和蛋白质浓度（利用考马斯亮蓝法）；目的是确定每一步的纯化效果。,测定蛋白质浓度：从试管中分别取0.2ml，用0.9%NaCl定容至20ml，置于试管中。,测定酶活力：将试管按以下比例稀释：1ml4ml K2HPO4 0.5ml 4.5ml K2HPO4 0.5ml 4.5ml K2HPO4 0.5ml 4.5ml K2HPO4 向石英比色皿中依次加入0.06M焦磷酸钠 0.5ml，3M乙醇 0.1ml，0.0015M NAD 0.1ml，蒸馏水 2.2ml，稀释的样液 1ml（对照液中加蒸馏水）。每隔15s测一次A340，直至不变。以每分钟A340增加0.001为1个酶活力单位。,5、作业,原始数据：记录每次纯化所得溶液体积，测定蛋白质浓度的OD值，测定酶活力的OD值变化情况。实验报告：画书上P.238的表62并填写,C=AB，EAD，FD/B,
