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1、实验二 蛋白质含量的测定凯氏定氮法,一 目的：学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理掌握蒸馏、滴定操作技术,三聚氰胺C3N6H6,“蛋白精”,二、原理：蛋白质含N量约为16，测出含氮量推知蛋白含量。,消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮-硫酸铵。添加硫酸铜和硫酸钾的混合物，前者为催化剂，后者提高硫酸沸点。CH2NH2COOH+3H2SO4 2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏吸收：浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到硼酸溶液中，硼酸吸氨后使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂变色(NH4)2SO4+2NaOH Na2
2、SO4+2H2O+2NH3 NH3+HBO2 NH4BO2（H3BO3 HBO2+H2O）滴定：标准HCl滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)，计算出样品中的总氮量。NH4BO2+HCl HBO2+NH4Cl,消化,蒸馏、吸收,滴定,三、试剂与器材,1、消化液：H2O2：H2S04：H2O=3：2：12、粉末硫酸钾硫酸铜混合物 K2S04与CuS04.5H20以 3：1混合3、30氢氧化钠溶液4、2硼酸溶液 5、标准盐酸溶液(约0.01 molL)6、混合指示剂(田氏指示剂)由50mL 0.1甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1甲基红乙醇溶
3、液混合配成，棕色瓶贮存。酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。7、待测样品,1.凯氏烧瓶2.凯氏定氮仪3.分析天平 4.酸式滴定管5.烘箱6.消化炉7.容量瓶 等等,四、操作方法,1.消化前样品处理 固体样品:某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示()。固体样品105烘干至恒重。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。,2、消化,取凯氏烧瓶 标号。各加几颗玻璃珠;1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂200 m
4、g，消化液5 mL。3及4号瓶中各加相同量的催化剂和消化液-对照，以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。消化开始时应控制火力，不使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力消化，直至消化液呈透明淡绿色。定容：冷却后，加蒸馏水(慢加，随加随摇)。将瓶中液体倾入50 mL或100 mL容量瓶，并以蒸馏水洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶，定容。,加样时应直接送人瓶底，不要沾在瓶口和瓶颈上。,3、蒸馏吸收：改进型凯氏定氮仪,特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。1)水蒸汽发生器和反应室2)冷凝器和通气室3)排水柱关键：搞清水管系统,蒸馏器的
5、洗涤,.接通冷凝水，向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)，酒精灯加热烧开。.水的自动喷出：将蒸馏水从加样室加入反应室将酒精灯移开片刻，反应室内水自动喷出到蒸汽发生器打开蒸汽发生器出水口，放水。如此反复清洗3-5次。.清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2硼酸溶液和12滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。,蒸馏吸收,准备:取50 mL锥形瓶3个，各加入5 mL 硼酸溶液和1滴指示剂，溶液呈淡紫色，表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将锥形瓶放在冷凝器下，冷凝器下端浸没在液体内。加样:移液管取3 mL消化液（空白液和样品消化液分别做
6、），加入反应室，用小量筒加NaOH溶液5mL，关闭自由夹，少量水封口。蒸馏:关闭自由夹，打开冷凝水。点燃酒精灯，蒸馏开始，锥形瓶中溶液由淡紫色变绿时(约2-3分钟)开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，表面皿覆盖。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。重复3次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。,4、滴定,全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。注意：使用前检查酸式滴定管漏不漏？漏的话，涂凡士林 滴定时一边滴一边摇，防止滴定过头！及时记录读数要求：
7、空白液1次，样品消化液2次,5、计算,总氮量()=c为标准盐酸溶液摩尔浓度(0.0098M)；V1为滴定样品消化液用去的盐酸溶液平均mL数；V2为滴定空白液用去的盐酸溶液mL数；w为样品重量(1g)。14为氮的相对量子质量。消化液总量500ml,蒸馏时消化液用量3ml,样品蛋白质含量()=总氮量6.25,注意事项,冷凝水的开、关自由夹：中间酒精灯：加到2/3，防止燃烧中途不够蒸汽发生器中：水到瓶颈凹陷处火焰小心照看，防止反应液喷出防止烧到橡胶管冷凝管末端不用时防在干净的烧杯中，防止NaOH污染空白：蒸10分钟未变色，再蒸3分钟铁架台：夹子口朝上,思考题,1、何谓消化？如何判断消化终点？2、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？3、固体样品为什么要烘干？4、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？5、如何证明蒸馏器洗涤干净？6、本实验应如何避免误差？,
