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1、实验五 层析技术,离子交换层析 薄层层析 纸层析 凝胶过滤层析 HPLC,层析法又称色谱法（Chromatography）,是利用混合物中各组分理化性质（如溶解度、极性、吸附力、亲和力、电荷和分子量等）的差异，将多组分混合物中的物质进行分离、分析和纯化的一种技术是利用混合物中各组分在两相（固定相和流动相）间进行分配。当流动相携带混合物经过固定相时，即与固定相相互作用，由于各组分的理化性质、分子结构等的不同，使得待分离物质与固定相的作用程度存在着差异（即不同组分具有不同的分配系数），不同组分在固定相中的滞留时间不同，从而随流动相移动的速率也有所不同，最终达到各组分彼此分离的目的。是生物样品或生物
2、分子分离分析的重要方法之一。,基本概念,1固定相（stationary phase）：是由层析基质组成，包括固体物质（如吸附剂、离子交换剂）和液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与有关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。2流动相（mobile phase）：在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析时，又称洗脱剂。在薄层层析时又称展层剂。3分配系数（partition coefficient，K）：指某一组分在固定相与流动相中浓度的比值。K=CA/CB CA：物质在A相(固定相)中浓度，CB：物质在B相（流动相）中的浓度4迁移率（Rf）：指某一组分
3、在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。,几种常用的层析方法,1吸附层析（adsorption chromatography）：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能力的差异进行分离。当各组分随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对待分离混合物中各组分的吸附力不同，导致各组分随流动相移动的速度不同，最终使得混合物中的各组分得以分离。吸附层析的效果如何取决于待分离物质被吸附剂（固定相）吸附结合的能力，以及其在流动相中溶解度的差异。氧化铝、硅胶等物质吸具有吸附其它物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同，是最为常用的吸附剂。薄层层析是吸附层析的一种类型。,薄层层析（thin
4、 layer chromatography）：将固定相（吸附剂）在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。,薄层层析分离脂类,【基本原理】通过硅胶对不同的脂类物质具有不同的吸附能力（亦存在两相溶剂中的分溶分配作用）。在展开剂（移动相）展层过程中脂类物质在两相之间重复进行吸附-解吸-再吸附-再解吸,使各种脂类物质随展开剂移行。与固定相（硅胶）吸附能力弱的和/或在移动相中溶解度大的脂类物质随展开剂移行到较远的距离，而与固定相吸附能力强的
5、和/或在移动相中溶解度小的脂类物质，在展开过程中移行慢，落在后面，这样展开一段时间后将各种脂类物质彼此分离开来。薄层层析是一项常用的分离、鉴定脂类的技术。本实验以硅胶G作固定相，以石油醚-丁酮-乙酸混合溶剂为流动相。样本：胆固醇，卵磷脂，三油酸甘油酯，菜油，卵黄,【操作步骤】,1层析薄板的制作：称取硅胶G 2g置研钵中加入0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速倒在8 cm12 cm玻片上，水平放置，使分布均匀，待其凝固后，置100烘箱中烘干备用。2点样及展层：分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5 cm高度处取间距为1 cm点样，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标本缸中，点样
6、一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸入展开剂中。3显色：约半小时后，当展开剂上升至适当高度（接近薄板上端）将薄板取出烘干，喷以磷钼酸显色剂,烘干.比较各种脂质和试样所显斑点位置，作图记录之，计算Rf值，即斑点中心至原点的距离（cm）展开剂扩展前沿至原点的距离（cm）。,2.分配层析（partition chromatography）,利用不同物质在流动相和固定相之间的溶解度和分配系数不同，使物质分离。溶剂之一通常是水，它是保持在固定的支持相之中（用淀粉、纤维素粉、滤纸等惰性材料制成），另一溶剂是移动相，由水饱和的有机溶剂组成。被分离的物质，如果彼此之间分配系数相差较大，就容易被分离开
7、。纸层析（paper chromatography）：以滤纸作为支持物的分配层析,纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。纸层析对混合物进行分离时发生两种作用：第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相之间进行分配（即液-液分配）；第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固-液分配）。虽然混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果，但主要决定于液-液分配作用。,纸层析（paper chromatography）,转氨基作用的验证纸层析法,【基本原理】体内-氨基酸的-NH2在氨基转移酶的作用下，移换至-酮酸的过
8、程，称氨基移换作用。本实验是将Glu与丙酮酸在肝匀浆中的谷-丙转氨酶的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中Ala的生成。由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。,【操作步骤】,一、肝匀浆的制备 取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，剖腹取出肝脏，经生理盐水洗去血污后，称取肝脏约1 g，置研钵中加入玻璃砂少许，然后加0.01 mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液5 mL磨成匀浆。,二、转氨酶反应取离心管2只（短试管，10cm高度），编号1、2，各加肝匀浆10滴，然后将2
9、号管置沸水浴中5分钟。两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40水浴中保温30分钟。取出，向两管各加5%Hac溶液2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后离心(2000 r/min，5 min)，将上清液移入另外同样编号的2ml小塑料离心管中备用。,三、层析验证,1在10 cm20 cm滤纸上，距短边2.5 cm处用铅笔轻轻画一线(原线)，在原线上，每隔1.5cm处用铅笔作记号，并在线下底边注明1、2、谷氨酸、丙氨酸记号。2用毛细管分别吸取1号液、2号液在层析滤纸上点样，注意斑点不可太大，一般直径约0.3 cm为宜，等干后，在1、2号原点上，再重复
10、点一次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中展开1.52h。3取出滤纸吹风烘干，喷以0.1%茚三酮乙醇溶液，吹风烘干，观察层析出现的斑点并解释之。,3离子交换层析（ion-exchange chromatography）,离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力的不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。,离子交换层析分离混合氨基酸,氨基酸是两性电解质，每一种氨基酸都有它特定的等电点，各种氨基酸在pH小于其等电点的溶液中以阳离子的形式存在，可以与阳离子交换剂进
11、行交换，再慢慢增大洗脱液的pH，氨基酸将依照其等电点由小到大的顺序逐渐洗脱，此时分部收集各洗脱组分，即可将各种氨基酸一一分离。,本实验以天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）混合物为例，利用磺酸型阳离子交换树脂（国产732树脂）将二者分别从混合物中分离。天冬氨酸是酸性氨基酸，pI=2.98；精氨酸是碱性氨基酸，pI=10.76。根据其等电点：首先选择0.1M柠檬酸缓冲液（pH2.2），将它们都吸附在阳离子交换剂上，再用0.1M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）洗脱天冬氨酸，用0.1M NaOH溶液洗脱精氨酸。,【操作步骤】,1填料的预处理：在一只100ml烧杯中，置约10g树脂，加2M HCl 25m
12、l，搅匀，放置2小时，倾弃上层酸液，蒸馏水洗3次，再加2 M NaOH 25ml，搅匀，放置2小时，倾弃上层碱液，用蒸馏水洗至中性（pH试纸检查）。将树脂悬浮于大约50ml pH 2.2的0.1M柠檬酸缓冲液中备用。2装柱：取内径0.8cm、长20cm层析柱一支，如（图5-1）安装，夹好“再”形夹，将上述备用的 树脂悬液倒入层析柱，使树脂自由沉降，并打开“再”形夹，缓慢放出液体，沉积后树脂床高应为78cm，当液面慢慢降至树脂面时，关闭下端“再”形夹。（注意在整个操作过程中，应防止液面低于树脂面，当液面低于树脂面时，空气进入树脂内形成气泡，妨碍层析效果）。,加样：将混合氨基酸溶液0.1ml沿层析
13、柱内壁缓缓加入，打开开关，使样品液缓缓流进柱床，流速为10滴/min。样品全部进入柱床后，用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液2ml，分两次先后加入洗柱。洗脱Asp及检测：洗脱：用0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，边加洗脱液边收集，流速 10滴/min，每管收集1ml。所有收集管分次用茚三酮反应检测氨基酸。检测：在收集管中（含收集液1ml）加入0.2%茚三酮溶液1ml；0.5M，pH 5.0柠檬酸缓冲液1ml混匀，置沸水浴中10min，溶液显兰紫色者为氨基酸阳性反应茚三酮反应检测连续两管呈阴性，表明Asp被洗脱彻底，然后开始进行用NaOH洗脱Arg,5洗脱Arg及检测：洗脱：用0.1M Na
14、OH以同样流速及收集体积洗脱Arg，并对各管收集液进行氨基酸。检测：在收集管（含收集液1ml）中加入酸性茚三酮溶液1ml；0.5M pH5.0柠檬酸缓冲液1ml混匀，置沸水浴10min，观察颜色反应。茚三酮反应检测连续两管呈阴性，表明Arg 被洗脱彻底。然后用PH2.2的柠檬酸缓冲液将离子柱洗到酸性状态。,4凝胶层析（gel chromatography）,利用凝胶对分子量不同的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。是选用孔径大小一定的凝胶，将混合液中的小分子物质“筛”开来的一种分离方法。具有所需设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好，特别是不改变样品的生物活性等优点，广泛地用于生
15、物分子的分离纯化以及蛋白质相对分子质量的测定、脱盐和浓缩等。当混合的蛋白质溶液通过凝胶柱时，分子直径小于凝胶孔隙的蛋白可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的蛋白不能进入。因此，小分子蛋白质通过胶粒时流程长，流速慢。而大分子蛋白质不能进入胶粒内部，通过胶粒间的空隙而流出，流程短，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开。,凝胶层析法分离血红蛋白和DNP鱼精蛋白,【基本原理】血红蛋白的分子量为67000；鱼精蛋白的分子量为10005000，利用凝胶层析法可以将它们从混合物中分离开。血红蛋白不能进入凝胶内部，随洗脱液直接流出，鱼精蛋白分子量较小，可以进入凝胶内部，它的流经途径较长，较后流
16、出层析柱。根据被分离物质分子量，我们选择的凝胶是Sephadex G50，它的分子量适用范围为1，50030，000。血红蛋白本身有红色，鱼精蛋白无色，故将黄色的DNP（2，4二硝基氟苯）偶联于鱼精蛋白，使其着色，便于观察。,【操作步骤】1凝胶的准备 称取l g Sephadex G50，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，沸水浴中放置1小时，冷至室温备用。2装柱 取直径0.81.2cm，长2530cm的层析柱一支，垂直安装于铁架台上。底部填少许玻璃纤维，下部装一“再”形夹以调节流速（见图4-1）。首先关闭“再”形夹，自顶部缓缓加入上述备用的Sephadex G50 悬液，待底部凝胶沉积12cm时
17、，打开“再”形夹，并边缓加Sephadex G50悬液，边调整适当流速，至凝胶层积集约18cm高，停止加Sephadex G50悬液，连通洗脱液，进行平衡（调整流速）。操作过程中，应防止气泡进入和凝胶分层现象。3样品制备 临上样前，将0.3ml血红蛋白溶液和0.5ml DNP鱼精蛋白溶液混匀即可。4加样与洗脱 切断洗脱液，当层析柱中液面下降与凝胶表层平齐时，即用滴管将样品液缓缓沿柱壁加入，不使凝胶表层扰动，待样品液面与凝胶表层平齐时，再加少许蒸馏水，开始洗脱。注意观察层析柱中红色的血红蛋白与黄色的DNP鱼精蛋白分离的情况，记录现象。,5.高效液相层析(high performance liqu
18、id Chromatography，HPLC),HPLC是在经典层析方法的基础上，引入了气相层析的理论，用高压输送流动相（压力可达5107Pa），色谱柱内填充小颗粒的填料，这些填料的刚性很好，可以耐受较大的压力，由于填料的颗粒很小，层析柱的分离效果远远高于传统的液相层析。,HPLC按固定相的不同可分为高效凝胶层析高效离子交换层析反相高效液相层析高效亲和液相层析疏水性高效液相层析等。用不同类型的HPLC分离或分析各种化合物的原理与相应的普通液相层析的原理相似，所不同的是HPLC具有以下一些特点,高压 由于填料的颗粒很小，而且压得很紧，流动相流动时所受的阻力很大，必须施以高压才能加快流速，一般的压
19、力在107Pa水平上。高速 由于高压，流动相的流速相对较快，每分钟有几毫升，又由于柱子较短，一般在50mm以内，所以HPLC所需的分析时间比传统的层析方法用时少。高效 由于柱内填料（基质）的颗粒小，理论塔板数相对于传统的层析柱更高，所以HPLC的分离效率高于其他层析方法。,样品用量少、灵敏度高 由于HPLC可以配备各种高灵敏度的检测器，大大提高了分析的灵敏度，如荧光检测器的检测灵敏度可达10-11g，分析的样品用量少，一般为几个微升。适用范围广 HPLC只要分析样品能制成溶液就可以进行分析，高沸点、热稳定性差、相对分子量大（400 Da）的有机物（几乎占有机物总数的75%80%）原则上都可以应用HPLC来进行分离、分析。在已知的化合物中，能用气相层析分析的约占20%，而能用HPLC分析的约占75%80%。,
