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1、实验五 平板菌落计数法,实验原理,平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。,优缺点,能分辨活菌由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成一个单菌落也可能来自样品中的23或更多个细胞。因此，平板菌落计数的结果往往偏低。时间长，繁琐。,四、操作步骤,1编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套，另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6
2、。,2稀释 取0.5mL已充分混匀的大肠杆菌菌悬液(待测样品)，至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将10-1 试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。用1mL吸管插入10-1 试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底。吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10-1 菌液0.5mL，放至10-2试管中，此即为100倍稀释。其余依次类推，整个过程如下页图所示。,3、取样 用三支1mL无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各1mL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2m1,一、混合法,4
3、倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45左右的培养基约15mL平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至45左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。,5计数 培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位(Cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数*5一般选择每个平板上长有30300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。同稀释度的三个重复对照
4、的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。,二、涂布法,先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒板，待凝固后编号，并于37左右的温箱中烘烤30min，或在超净工作台上适当吹干，然后无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上2030 min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置在37的恒温箱中培养2448h。涂布平板用的菌悬液量一般以0.1mL较为适宜，如果过少，菌液不易涂布
5、开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。,1结果,将培养后菌落计数结果填人下表：,2思考题,为什么融化后的培养基要冷却至45左右才能倒平板?要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么?试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。当平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？,革兰氏染色法,一、目的要求,学习并初步掌握革兰氏染色法。了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。,革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染
6、色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙醇）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。,原理,革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量
7、高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,三、实验器材,菌种：大肠杆菌约24h培养物蜡样芽孢杆菌1220h培养物。,1制片,取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热(以玻片不烫手为宜)。,2初染,滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色12min，水洗。,3媒染,用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。,4脱色,用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性苗，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌脱色时间一般约2030S。,5复染 用番红液复染约2min，水洗。6镜检 干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫 色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。,7混合涂片染色,按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。下图所示革兰氏染色操作过程。,Thank You！,
