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1、生物分离与纯化实验,共34学时,持续改进协作实验报告：1.信息栏填全，遗漏项：同组人员；2.结果计算：过程完整 3.讨论分析不可缺项，内容丰满，见解细致。,上次实验总结,实验（三）血清中抗体纯化（16学时）,配基 特异性Protein A许多IgGs 的Fc 片断Protein G许多IgGs 的Fc 片断Antigen特异的抗体Anti-IgG特异免疫球蛋白,抗体纯化配基类型,二、实验原理,低 pH下洗脱,用 rProtein A Sepharose 分离IgGColumn:HiTrap Protein A FF结合缓冲液:20 mM 磷酸钠,pH 7.0洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸-HC
2、l,pH 3注意:为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl,pH 7.5中,二、实验原理,二、实验原理蛋白 A 和 蛋白 G 的结合特异性,种属蛋白 A 蛋白 G结合结合人IgA可变的-IgD-IgEIgG1+IgG2+IgG3-+IgG4+IgM*可变的-鸟类蛋黄IgY-牛+狗+山羊-+豚鼠IgG1+IgG2+仓鼠+马+考拉-+骆驼-+,种属蛋白 A 蛋白 G结合结合恒河猴+大鼠IgG1+IgG2a+IgG2b+IgG3+IgM*可变的-猪+兔+小鼠IgG1-+IgG2a-+IgG2b-+IgG3+绵羊+/-+,+相对结合强度 弱或不结合,三、实验材料纯化,试剂：磷酸二
3、氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙醇；均为分析纯。容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管5个；100ml三角瓶 5个；250ml烧杯5个填料：Protein A层析柱：XK10或预充柱装柱体积：2ml血清：2ml滤器：0.45m针头式滤器5个；SDS-PAGE:,缓冲液：平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L)冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，pH7.2；(1L)洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L)清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)稀释血清：取2ml
4、血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。标记为S.,三、实验材料纯化,三、实验材料SDS-PAGE,试剂：1.2x样品缓冲液2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。3.pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4保存。4.pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4保存。5.TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵
5、（用重蒸水新鲜配制）7.pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4保存，临用前稀释10倍（减半配制）。8.考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。,三、实验试剂浓度测定,考马斯亮蓝G-250蛋白染色液(1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml）精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏水，定容到100ml.(2)考
6、马斯亮蓝G-250试剂 取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。,四、实验步骤,1.Protein A纯化：1）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20ml的标记，然后打开止水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。ProteinA填料中加入适量平衡缓冲液，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml平衡缓冲液不断加入柱内洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶柱应
7、符合无气泡、无节痕、床面平正。2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面中央2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止水夹，室温下样品与填料结合15min。,实验步骤1.Protein A纯化：,3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹，。4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出
8、速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液，收集2倍柱体积记为E2。5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡液5cv。,分离胶及浓缩胶的制备：1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照说明书提示装好玻璃板；3 按以下配置10%分离胶及浓缩胶,四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定,3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前
9、再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置10分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。,四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定,5、样品处理：还原样品：取30ul样品（S,W,E1 E2），加入30ul 还原上样缓冲液，100水浴5min，非还原样品加入30ul非还原上样缓冲液室温孵育5min。6、加样：拔出样梳后，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的
10、顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中S和Marker加样量为2 l，W,E1，E2加样量为15 l，还原与非还原样品间空一孔道。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。,四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定,7、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160 V，当进入分离胶后改为240 V，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。8、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液微波煮沸后，染色10min左右。剥胶时要小心，保持
11、胶完好无损，染色要充分。9、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水冲洗染色液，再用微波煮沸后的脱色液脱色，可更换2次，直到蛋白质区带清晰。,四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定,实验步骤3.蛋白质含量测定,1）取洗脱液E1，E2 0.5毫升，用蒸馏水稀释至5毫升，然后吸取稀释后的酶洗脱液G-25 0.5毫升，用考马斯亮蓝G-250染色法测定其蛋白质含量。,管号,数量,项目,标准曲线的制作和样品的测定,将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取marker中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线：logMW=K-bX以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量,分析抗体的纯度及分子量（还原，非还原）计算抗体总蛋白得率。,五、结果,下面开始实验！,
