《实验四+PCR及电泳技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四+PCR及电泳技术.ppt（24页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、实验4 PCR及电泳技术,1.PCR的基本原理,PCR基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的基本步聚 1、变性(Denaturation)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火(Annealing)：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸(Extension)：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR
2、循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template DNA by Heat(95),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCAT
3、CGACGCTGGATCG,加热94,引物酶,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(Tm)and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,引物酶,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,引物,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTA
4、GC,引物,3,5,5,3,PCR Cycle-Step 3-At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNAPolymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,3,5,3,
5、5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,DNA聚合酶,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,DNA聚合酶,5,5,3,3,引物,引物,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需2-4 min，2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,3,5,3,5,TAGCGCTATCGC
6、ATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,5,5,3,3,Target Amplification,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle=2 Amplicon,2 cycle=4 Amplicon,3 cycle=8 Amplicon,4 cycle=16 Amplicon,5 cycle=32 Am
7、plicon,6 cycle=64 Amplicon,7 cycle=128 Amplicon,PCR仪,PCR仪,PCR仪,1、PCR反应成分,1）模板 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。一般100ng DNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。,PCR反应体系,模板引物Taq DNA聚合酶4种dNTP混合物Mg2+10缓冲液,2）引物（1）浓度 0.1-0.5 M 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。,引物是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与
8、模板脱氧核糖核酸互补的程度；人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。,3）Taq DNA聚合酶一般0.5-2.5 U/50l；酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。,4）dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4）dNTP浓度取决于扩增片段的长度;四种dNTP浓度应相等;PCR常用的浓度为50-200M，不能低于10-15M。浓度过高会抑制Taq 酶的活性，易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量,5）10PCR缓冲液(Mg2+)：500 mM
9、KCl，100 mM Tris-HCl(pH 8.4)，150 mM MgCl2，1 mg/ml明胶。,PCR反应体系：10PCR buffer 2.5l dNTP mix 各0.5l 引物1 0.5 l 引物2 0.5 l DNA模板 2 l Taq 酶 0.5 l 加双蒸水至总体积为25l,PCR扩增程序:,94,300S 94,60S 55,60S 72,60S 72,7min,30 循环,2.电泳技术,电泳槽,制胶板,梳子,电源,电泳仪,提供稳定的电压或电流,电极缓冲液和凝胶的容器,形成点样孔,制备垂直或水平凝胶,电泳分离的原理,电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离
10、子)在电场中移动的现象。1、电荷效应 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。2、分子筛效应 不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。3、待分离生物大分子的性质 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。4、电场强度 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。,电泳技术的种类,按支持介质的不同可分为：纸电泳(Paper electrophorisis)醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis)琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrop
11、horesis)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。,琼脂糖凝胶电泳,对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关。,1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸；2、倒胶时温度要低于60且速度要慢；3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔；4、电泳仪打开前应检查电压、电流旋纽是否处于零位置，工作电压一般为60-80V，400mA，电泳完毕应将电压、电流旋钮恢复到零位置；5、防止EB污染和紫外灯伤眼。,注意事项：,不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围,M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK,M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CK,
