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1、实验四 血凝及血凝抑制实验,实验目的,1.了解血凝及血凝抑制实验原理2.掌握血凝及血凝抑制试验方法3.掌握基本操作技术,了解其实用价值,实验原理,凝集试验：颗粒性抗原与相应抗体结合后发生凝集的血清学试验。抗原与抗体复合物在电解质作用下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块。试验可在玻板上进行，称为玻板凝集试验，可用已知抗原检查未知抗体，或用于已知抗体诊断未知抗原，；亦可在试管中进行，称试管凝集试验，主要用于抗血清效价测定。,实验原理,某些病毒具有凝聚某些动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称为血球凝集试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但是病毒的血凝可为相
2、应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制实验，具有特异性，通过HA-HI实验，可用已知的血清来鉴定未知的病毒,血凝试验原理,血凝素（hemagglutinin HA）：（HA，从H1H15),呈柱状由病毒基因编码的糖蛋白刺突。功能：吸附细胞：与细胞上受体结合,使病毒侵入细胞凝集多种动物的红细胞（血凝试验）：HA能与人或其它动物多种红细胞表面N乙酰神经氨酸酶受体结合引起红细胞凝集具抗原性：其抗体能中和病毒-中和抗体：抑制血凝（血凝抑制试验）,血凝素（HA）柱状,流感病毒结构模式图,血凝原理,血凝抑制原理,血凝抑制试验原理病毒引起的血凝现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制，即抗体与病毒结合后，血凝素无法吸
3、附于红细胞表面的受体上，用免疫血清阻止红细胞凝集的现象，称为血凝抑制,实验材料器材：U型或V型微量反应板、微量移液器、枪头试剂：1%鸡红细胞、NDIV血凝素、NDIV抗血清、生理盐水,实验步骤1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水2.在第1孔内加入血凝素25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。,3.在1-12孔均加入25ul的生理盐水。4.在每孔内加入25ul1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感作15-30min
4、，每5min观察一次结果。5.计算血凝效价，稀释使成为四价备用以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1320，为1个单位，4个单位即为180稀释。下面前经校对取4个血凝单位用于实验,血凝试验结果判定,效价判定：凝集特别显著：“”凝集现象次之：“”凝集清楚可见：“”稍显凝集者：“”血凝效价：呈“”凝集时的最高稀释度。此时的稀释度即为1个血凝单位。,结果判定1.在各组对照均正确的情况下，按下列标准判定 血凝反应强度示意图“4”红细胞呈片状凝集，均匀布满孔底，边缘有时不整齐或皱缩。“3”红细胞呈片状凝集，但面积略小于“4+”。“2”
5、红细胞呈片状凝集，但有少许沉积孔底中部呈小圆点状。“”红细胞大部分沉于孔底中央，周围有少量散在凝集颗粒。“”红细胞均沉于孔底呈小圆点状，边缘整齐。2.对照孔正常的情况下，红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终点。凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。,血凝抑制1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1-10孔内加入25ul生理盐水，第11孔不加。第12孔加25ul生理盐水。2.在第1孔内加入被检血清25ul，混匀后吸出25ul加入第2孔内，再混匀后吸出25ul加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25ul。第12孔不加作阴性对照孔。,3.在1-12孔内均加入“
6、四价”血凝素25ul，震荡后，室温静止作用5min。4.在1-12 孔内均加入1%的鸡红细胞悬液25ul，震荡，室温感作15-30min，每5min观察一次结果。5.观测结果，记录实验数据,血凝抑制试验结果判定,测定孔 RBC沉于孔底中心，呈纽扣状。(+)凝集（-）病毒对照孔：凝集RBC对照孔：无自凝血凝抑制试验效价：呈完全血凝抑制的最高血清稀释度。,思考问题,1.计算出病毒的凝集价、血凝抑制价2.血凝试验中为什么要加补充液？3.为什么加病毒液和红细胞悬液时要反向加？4.病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应?血凝抑制实验是不是特异的抗原抗体反应?为什么?,凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价。能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液0.25ul为一个病毒凝集单位。凡能使4个凝集单位的病毒凝集红细胞的作用完全受到抑制的血清最高稀释倍数，称为血凝抑制价,
