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1、实验二 培养基的制备 消毒与灭菌,培养基配制实验原理,培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。,培养基配制要素,营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无机盐；适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；一定的氧化还原电位；合适的渗透压。,培养基的分类,根据微生物的种类和实验目的的不同，培养基分类可以按以下方式：按成分的不同分按培养基的物理状态分按培养基的用途分,按照培养基的成分来分,天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质合成培养基:用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基半合成培养基:以天然有机物作为微生物营
2、养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基,按照培养基的物理状态,固体培养基：加入凝固剂，如1.5%2.0%琼脂半固体培养基：加入少量凝固剂，如 0.2%0.7%琼脂液体培养基：不含任何凝固剂,按照培养基的用途分,基础培养基营养培养基（加富培养基）鉴别培养基：含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。选择培养基：利用微生物对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或
3、鉴别某种微生物的目的。,培养基灭菌,配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物微生物生长繁殖：消耗养分 改变培养的酸碱度 产生毒素或者抑制物,牛肉膏蛋白胨培养基的制备,应用最广泛的细菌基础培养基，普通培养基,牛肉膏：3 g蛋白胨：10 gNaCl：5 g琼脂：15-20 g水：1000 mLpH：7.47.6,马铃薯培养基（PDA）的制备,用来培养真菌,马铃薯：200 g蔗糖（葡萄糖）20 g琼脂：15-20 g水：1000 mLpH：自然,马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后用纱布过滤；滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL。,高氏号培养基的制备,用来培养放线菌,可溶性淀粉：20
4、 gKNO3：1 gNaCl：0.5 gK2HPO43H2O：0.5 g MgSO47H2O：0.5 g FeSO47H2O：0.01 g琼脂：20 g水：1000 mLpH：7.27.4,无氮培养基的制备,用来培养固氮菌,葡萄糖：10 gKH2PO4：0.2 g MgSO47H2O：0.2 g NaCl：0.2 gCaSO42H2O：0.2 gCaCO3：5 g琼脂：20 g水：1000 mLpH：7.07.2,豆芽汁培养基的制备,用来培养酵母菌,黄豆芽：10 0 g蔗糖（葡萄糖）：50 g琼脂：20 g水：1000 mLpH：自然,称取新鲜黄豆芽100 g，放入烧杯中加水煮沸约30 min
5、，用纱布过滤。滤液中加入糖和琼脂，溶化后补足水至1000 mL，最后灭菌。,麦氏（Meclary）培养基的制备,用来培养酵母菌，利于酿酒酵母子囊孢子的形成,葡萄糖：1 gKCl：1.8 g酵母浸膏：2.5 g 醋酸钠：8.2 g 琼脂：20 g水：1000 mLpH：自然,LB培养基的制备,用来培养细菌,蛋白胨：10 g酵母膏：5 gNaCl：10 g琼脂：20 g水：1000 mLpH：7.0,操作步骤,称量溶化补足水分，调pH（过滤）分装,6.加塞7.包扎8.灭菌9.搁置斜面10.无菌检查,称量药品时，严防药品混杂。称完一种药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。药品
6、不要弄错。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和无水形式的化合物要注意分辨。,培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。对于微量成分，可先配制成高浓度的储备液，按比例换算后再加入。琼脂溶化过程中，要控制火力并不断搅拌，以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基。,调pH值以前，先补足水分。pH值不要调过头，以免回调影响个离子浓度。,固体分装：不超过试管高度的1/5；不超过三角烧瓶容积的一半为宜。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免污
7、染棉塞而引起污染。,配好培养基后要贴上标签，写清培养基类型、组别、配制时间。,消毒与灭菌,消毒是一般指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体的过程。灭菌则是指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。,消毒与灭菌方法,加热灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤除菌辐射灭菌放射线辐照灭菌紫外线灭菌化学药品灭菌,干热灭菌,干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。干热灭菌有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。,细胞内蛋白质的凝固性与其
8、含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160170），时间要长（12h），但干热灭菌温度不能超过180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。,高压蒸气灭菌,高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀，继续加热。由于水蒸气无法排出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。一般培养基在0.1 MPa下，121维持1530 min可达到彻底
9、灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸气有潜热存在。1 g水在100时，由气态变为液态时可放出2.26 kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。,在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。当含盐类的液体和含盐的琼脂
10、中大量的盐类泼洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细擦干锅盖垫圈上的水滴。否则它们会带来腐蚀和变质。要检查压力表上的指数为“0 MPa”后才能打开锅盖。外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否则会引起装置故障、起火、短路。,过滤除菌,过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。,紫外线灭菌,紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与
11、强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。,紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前，可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯
12、照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。,灭菌的试管培养基冷至50 左右再搁置，以防斜面上冷凝水太多。斜面长度不超过试管总长的一半。,将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,实验任务,每组配制700 mL牛肉膏蛋白胨培养基（P241）趁热将培养基分装至6把试管（67支，不超过管高1/5）；剩余的培养基装入锥形瓶中（每瓶约150 mL）对试管、锥形瓶进行包装，贴上标签（培养基名称、配制时间、组别）高压蒸汽灭菌（121,灭菌20min）,作业,实验报告思考题1：培养基配置好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？思考题2：如果需要配制一种含有某抗生素的固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或工作浓度）为50ug/mL，你将如何操作？（提示：抗生素在高温下易失效）下一次实验：细菌的简单染色,
