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1、无创产前基因检测简介,内容提要,一，染色体非整倍体概述（唐氏综合征为例）,21、18、13-三体综合征是人类最常见的三种染色体疾病，患儿面容特殊，绝大多数为严重智力障碍及器官畸形，对家庭和社会造成巨大危害和负担。现代医学对胎儿染色体疾病尚无有效治疗方法，最好的方法是在孕期通过产前筛查及诊断，发现异常并及时采取相应措施,染色体非整倍体疾病临床表现,21三体照片,a.同源染色体不分离;b.姐妹染色单体不分离,二，染色体非整倍体病发病机理 减数分裂中染色体不分离,第一次减数分裂,第二次减数分裂,三，现有的产前筛查与诊断手段,产前筛查 母血清学筛查 颈项透明膜厚度筛查产前诊断 羊水穿刺 绒毛取样 脐静
2、脉穿刺,7,侵入性诊断方式,风险计算,现有产前筛查和产前诊断的缺陷性,1992-2006,传统诊断方法（穿刺）导致的正常胎儿流失,5619,最紧迫任务：,新方法的探索：提高检测的准确性与检出率、降低检测过程中的假阳性率和假阴性率。,四，无创产前基因检测技术产生前提一：孕妇外周血中存在胎儿DNA,胎儿DNA来源和特点,来源：1 胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；2 胎儿细胞凋亡；3 胎盘滋养层细胞的凋亡基本特点：1 含量有一定的变化规律。妊娠第4周开始可检出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，存在个体差异，平均浓度。2 分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3
3、min(4-30min)，2h就无法检出。再次妊娠不影响检测结果。3 DNA片段较小，平均166bp左右。常规技术很难检测,前提二：第二代高通量测序仪发明,6亿个DNA片段/次，全基因组测序只要10天/台；90个DNA片段/次，全基因组测通要50年/台。,（2012年）,无创产前基因检测：母血浆DNA+高通量测序,2023/6/21,13,Unique reads(单一序列读取）:no mismatch,one location,(Lo et al,PNAS,2008),理论模型,母亲Chr 21：952=190,以21-三体为例：100 DNA单位/毫升血浆。其中，95个单位来源于母亲，5个
4、单位来源于胎儿,通过大规模并行测序，获得分布在每条染色体上的真实的核酸片段数量，经过计数与比较：正常胎儿 或者 21-三体胎儿,正常胎儿 Chr 21：52=10,母亲Chr 21：952=190,21-三体胎儿 Chr 21：53=15,医 院,华大基因,无创产前基因检测流程,准确性高于99%；早期诊断，12孕周即可检测；减少妊娠晚期引产对孕妇造成的伤害；非侵入性，减轻孕妇心理负担，无流产风险以及产前诊断引起的并发症；可以同时检测其它染色体异常所需样本量少，只需5毫升母体外周血。,无创产前基因检测的优势：,无创产前基因检测的优势：保险保障,检测结果为高风险受检者产前诊断所产生的费用含：羊膜腔
5、穿刺术(或经皮脐静脉穿刺术)和染色体核型分析和染色体荧光原位杂交（或FISH），保险公司给予报销超过2500元。检测结果为低风险，若受检者婴儿出生后一年内经县级以上检测医院专科医生明确诊断患有“21-三体综合征”、“18-三体综合征”、“13-三体综合征”，保险公司支付受检者保险二十万元整,孕期各项检测信息图,10-13.5周,早孕期筛查(检出率85%),中孕期筛查(检出率81%),15-20周,16-22周羊水穿刺（流产率0.5-1%）,9-11周绒毛取样（流产率1-5%）,24-28周 脐带血取样（流产率1-3%）,0,40周,12-24周无创产前基因检测（准确率99%）,适应人群和适应症
6、,经B超确认为单、活胎孕妇；可检测胎儿-13三体、18三体和21三体；孕12周以上均可进行检测。,禁忌人群、禁忌症,怀多胞胎的孕妇；孕妇本人为染色体非整倍体疾病患者；孕妇接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗、接受过配偶或亲属淋巴细胞免疫治疗等；无法精确检测胎儿染色体嵌合型、易位型、微缺失、微重复、微缺失等结构性异常；,院内流程,检测前确认事项：1.单活胎（超声确认）2.孕后未接受过异体的血液制品；3.孕12周以后开始检测,产前诊断中心/产科就诊,医生解释该项目孕妇签署知情同意书/送检单,领取保险卡,孕妇交费后返回产前诊断护士站抽血（附知情同意/送检单）,采血：EDTA抗凝管采集外周血5ml（轻
7、微颠倒采血管4次）,护士打印2张条形码1张贴于采血管上，1张贴于申请单的右上角,采血后护士立即交给标本处理人员（附申请单）（产前诊断中心3楼标本接收处（标本4保存，不可室温放置）；标本处理人员8小时内分离血浆，并填写样本信息单,全血采集,抽取孕妇外周血5 mL，采用 EDTA 抗凝；采血完毕后，轻微颠倒采血管4次，并及时将采血管放置于4冰箱中，在4小时内进行血浆分离工作。【注意事项】采血时孕妇无需空腹；采血管为 5 mL EDTA 抗凝管；颠倒混匀时动作不能太剧烈，防止溶血。,血浆分离（本步骤在华大基因完成）,1、将采血管4 1600g离心10min，上清（血浆）分装到置于冰盒上且已编号的2.
8、0ml的 EP 管中。【注意事项】1）严格核对样本编号、确保编号唯一；2）开启离心管时，不能碰到管内盖；3）吸取血浆过程中不要吸到中间层的白细胞；2、上述血浆 4 16000g 离心10 min，冰盒上将上清转入已编号的2.0ml EP 管中，每个离心管转入600ul血浆。同时在每个2.0ml离心管上标记样本编号、血浆体积、分离日期。【注意事项】1）严格核对样本编号、确保样本编号唯一；2）开启离心管管盖时，不能碰到离心管内盖；3）将分离好的血浆贴上对应的条码并用封口膜密封，密封结束后立即将血浆放入-20 或-80 冰箱中，避免反复冻融。【注意事项】全血须保证在8小时内进行血浆分离；分离后的血浆
9、在-20 冰箱中可保存3天，长期保存需存放于-80 冰箱。,样本储存与运输,1、全血样本在冰袋(4)条件下运输，且在4小时内送达样本接收处，样本接收后要立即完成血浆分离。2、血浆样本在干冰（-20）条件下运输，并确保样本送达时有干冰剩余，到达后及时存放于-80 冰箱中，禁止将样本在室温下放置。【注意事项】1）泡沫箱的规格：壁厚6cm、外径长39cm、外径宽32cm、外径高35cm。2）干冰用量：10公斤/2-3天；15公斤/4-5天；根据运送时间的长短，相应增加干冰用量。,数据统计（截至2012年3月）,全球100多家合作医院。完成核型验证3476例，产后随访验证5489例。,病例分析：单纯型
10、/标准型,标准型T21,样本编号：PDP10003761孕妇年龄：31唐 筛：1/510（低风险）无创检测：T21核型分析：47，XX，+21,T13 样本编号：PDP100003321 孕妇年龄：32 无创检测：T13 核型分析：47，XX，+13,病例分析：单纯型/标准型,T18 样本编号：PDP100002190 孕妇年龄：32 无创检测：T18 核型分析：47，XY，+18,T9 PDB11AJ00026，41岁，孕23w+4周 无创检测：T9 羊水核型：T9,T16 PDB11AJ00783，30岁，孕19周 无创检测：16号染色体偏多 羊水FISH：T16,病例分析：其它染色非整倍
11、体,病例分析：T9嵌合体,PDB11AG00106，39岁，孕20周无创检测：两次测序结果均显示9号染色体偏多羊水核型：47,XX,+955/46,XX33脐血核型：47,XX,+93/46,XX,225晚期B超发现严重畸形，已引产,胎儿核型,项目总结,该检测技术覆盖所有染色体，可精确检测21、18、13、X、Y等染色体非整倍体。建立了较完善的检测流程和质量控制体系自主开发的信息分析方法确保统计分析的准确性和可持续性全球最大的样本量检测，可为技术标准的建立提供数据挑战与展望：随访和跟踪，医学伦理 技术准入、临床应用规范、检测前后的遗传咨询 方法学优化、测序通量提升带来成本降低，可广泛应用于产前筛查 测序速度提升带来检测周期的大幅缩短 技术突破（提高性染色体、易位型和嵌合体型、多胎妊娠精确度）,
