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1、时间分辨荧光免疫技术,问 题,什么是时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）？TrFIA的标记物及特点。为什么叫“时间分辨”?TrFIA的检测原理各种免疫方法学的比较 TrFIA的 临床应用,时间分辨荧光免疫（TrFIA）（Time-Resoled Fluoroimmunoassay）,定 义,TrFIA分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，当反应体系发生后，用TRF仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。,发展历程,1979年，芬兰SOINI和
2、HEMMIA 提出“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年SOINI和KOJOLA 提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量分析技术 现已经成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。,厂 家,芬兰的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研WALLAC和新波公司使用疝灯，主要用于临床,标记物为具有独特荧光特性的稀土金属-镧系元素,镧系元素共有15种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐Sm)、镝(Dy)、铽(Te)Eu3+的应用最为广泛，Sm3+可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术 不同
3、的三价稀土离子具有不同发射光谱和各自不同的荧光寿命等特点，这样就适合进行双标记和多标记，从而实现可同时检测一个样品中，两种或两种以上的抗原或抗体，即一个试剂盒相当与两个试剂盒或多个试剂盒，这就是我们所说的多标记技术。,镧系元素荧光特点：荧光寿命极长镧系元素螯合物（60900 us)普通荧光免疫中荧光团：1100ns样本中蛋白质荧光：110ns，易猝灭。Stokes位移大铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移近280nm荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615 5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,时间分辨,生物制品（如蛋白质）本身产生的荧光波长位于400-6
4、00nm，所以用普通荧光素来检测生物样品时，自然本底的荧光干扰太大。样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为1-10nsTrFIA技术中，由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅强度高，而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6个数量级（1000ns=1us)。含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图1）。消除了来自样品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的时间分辨。,通过时
5、间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使本底达到0,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光。而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0,图1,Stokes位移,Stokes位移：是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。例如TRF中铕的激发光波长340nm,发射光波长613nm，两者之间的波长差即Stokes位移为273nm（见图2），所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分开。而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差即Stokes位移为28nm，那就很难排除激发光对发射光的干扰，影响检测结果。,利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一
6、保障,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。,图2,稀土离子激发光、发射光和Stokes位移,解离增强技术,解离增强技术是TRF技术中所特有的指当免疫反应完成后部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。再加入低PH值（PH23）的增强液，把Eu或Sm从免疫复合物中解离下来，与增强液中的螯合物质（-二酮体）结合形成新的螯合物，使标记物产生的荧光强度增强近百万倍,时间分辨荧光免疫的原理,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、核酸探针等物质；当免疫过程结束后，根据稀土离子螯合物的荧
7、光光谱的物理特点（特异性强、Stokes位移大、寿命长），并采用解离-增强技术（DELFIA）放大有效荧光；最后用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据已知浓度所确定的标准曲线，来判断未知样品的浓度值，以达到定量分析的目的。,时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）,乙肝“两对半”TRFIA定量检测原理示意图,乙肝表面抗原免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝表面抗体免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝抗原免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝抗体免疫反应图（时间分辨荧光法）,乙肝核心抗体免疫反应图（时间分辨荧光法）,时间分
8、辨荧光免疫的试剂种类,甲状腺功能检测TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG性激素类检测FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG肿瘤标记检测AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199遗传科检查产前筛查：hAFP/HCG，PAPPA新生儿筛查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU传染病检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb血液科检测贫血检查：Fer
9、ritin，Vit B12，Folic acid科研工具单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测,时间分辨荧光免疫分析与其它免疫学方法的比较,标记免疫学发展历程,酶联免疫（精度：10-9 mol/L）放射免疫（精度：10-12mol/L）化学发光（精度：10-15mol/L）电化学发光（精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）生物芯片（未知）,酶免疫技术 荧光抗体技术 三大标记技术 放射免疫分析,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs(药物浓度),Thyroi
10、d Hormone(甲状腺激素),Fertility Hormone(孕激素),Cancer Markers(肿瘤标记物),Infectious Disease(传染病),Vitamins(维生素),Serum Proteins(血清蛋白),10-12,10-9,10-6,10-3,10-0,各种免疫方法学的比较,放射性免疫分析法（RIA）-标记物：125I,应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。,缺点放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚
11、存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。,酶免疫分析法（ELISA）-标记物：HRP(辣根过氧化物酶）,应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术磁酶免分析曾经一度被认为是取代放免的检测手段。,缺点灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。,化学发光免疫分析法（CLIA）-标记物：化学发光物质（鲁米诺）,应 用单个样本
12、检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。仪器种类：拜耳 ACS180 系列雅培 AXSYM贝克曼 ACCESS德普 IMMULITE,缺 点样品不能重复检测；出现故障则整批试剂及血样报废。本底较高，易受环境物质干扰。仪器故障率较高。标准曲线稳定性较差，需多次定标。检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂；试剂价格高。,电化学发光免疫分析（ECL）-标记物：三联吡啶钌,应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。,缺点仪器检测速度慢（罗氏公司
13、）ECL1010 60 测试/小时ECL2010 90 测试/小时非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。,TRFIA在乙肝“两对半”定量检测应用,一、提高了检测的灵敏度 时间分辨荧光法（TRFIA）检测HBsAg灵敏度可达到0.2ng/ml，而酶免法（ELISA）检测HBsAg灵敏度是2ng/ml。缩短了急性乙肝检测的“窗口期”,二、动态观察疗效和病情检测 疾病的发生、发展、疗效、预后是个动态的变化过程，TRFIA定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙肝的病程、治疗、预后起到动态检测的作用，指导医生治疗。,（1）定量分析HBsAg和HBsAb浓度的变化，可以预见急性乙肝是否处于
14、恢复期 如HBsAg浓度降低，HBsAb逐渐升高，说明病情正向恢复期发展反之。反之，HBsAg浓度处于高水平或上升，而HBsAb处于低水平，则容易发展为慢性乙肝或携带者。,（2）定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可以反映病情变化和治疗效果。1、HBeAg向HBeAb转换时期，即表现为HBeAg浓度下降和HBeAb浓度升高。2、高浓度的HBeAg提示病毒处于高复制状态，有较强传染性。3、高浓度的HBeAb一方面提示病情的好转，但在有些时候（如肝功能指标很差）可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。,（3）HBcAb浓度的高低可以反映病毒感染的状态 1、乙肝急性感染常为高滴度的HBcAb，恢复期浓
15、度下降，慢性乙肝HBcAb呈持续高浓度。2、低浓度的HBcAb一般为恢复期或既往感染。,（4）有利于对慢性肝炎活动性和非活动性的判断,非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定 活动性慢性乙肝往往呈进行性变化,三、乙肝疫苗接种 HBsAb是一种真正意义的保护性抗体，其定量的检测可以对其具有的免疫力做出正确的评价，对乙肝的预防起到监督作用。,由此可见定量测定对乙肝疫苗免疫力的评估和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面,四、HBV血清学标志物与HBV-DNA的关系血清学标志物 反映机体对病毒的免疫状态，病程，判断病情，不能完全反映病毒在体内的复制状况HBV-DNA 1、真实反映病毒在体
16、内复制水平，观察药物疗效 2、部分“小三阳”及低水平病毒复制时出现阴性 3、不能反映机体的免疫状态和病情,血清HBV-DNA荧光定量PCR测定可以直接反映病毒的数量，病毒的复制情况，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒的状态,HBV-DNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确的判断预后和治疗,时间分辨法检测“乙肝两对半”的意义,原子标记、灵敏度高，有效区分弱阳性与阴性，减少灰区两步法采用，最大限度避免HOKE现象出现。（即强阳性的标本检测为阴性）定量检测可以动态观察治疗效果乙肝疫苗接种的量化评价结果准确可靠，价格适中,NCU/ml单位来源,National Center for Clinical Laboratory,(NCCL)国家卫生部临检中心,NC UNIT NCU/ml,半自动 ANYTEST2000,谢谢！,谢 谢！,放映结束 感谢各位批评指导！,让我们共同进步,
