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1、昆虫病毒的利用,主讲人：龚静（2004级硕士研究生）,主要内容,1 前言2 昆虫病毒的类群 3 重要昆虫病毒概述 4 昆虫病毒的生产 5 昆虫病毒在害虫防治上的应用,1.前言,昆虫病毒是引起昆虫致病和死亡的重要病原体。最早关于昆虫病毒的记载是中国，在1149年出版的农书中，就记载有家蚕的“高节”“脚肿”病，这就是现在所称的核型多角体病毒病。,2 昆虫病毒的类群,病毒virus：一类形态最小，结构最简单的微生物。由单一的核酸(RNA或DNA)组成中心核、核外包裹一层外壳蛋白组成。病毒病viral disease：由病毒病原体引起的疾病。,2.1 昆虫病毒的基本特征,昆虫病毒的一般构造：-昆虫病毒
2、是一类没有细胞构造的生物体-主要组成是核酸和蛋白质。-病毒个体称为病毒粒子(virion)，由两部分构成：内面是核心（core），成分为核酸；外层是衣壳(capsid)，成分是蛋白质。有些衣壳外包被有囊膜。成分为脂类。核酸的功能是携带遗传信息，决定病毒的遗传变异性和传染性。蛋白质的功能是保护核酸，并决定病毒的抗原性。,不同种类病毒的结构,2.1 昆虫病毒的基本特征,昆虫病毒的侵染活动：在寄主外存在时没有代谢、生长和繁殖，只保留在适宜条件下侵染寄主的潜在能力。在不适宜的环境下活性较易丧失。对温度很敏感，在55 60时，病毒悬液几分钟内就会变性。X-射线、-射线和紫外线照射能使病毒变性失活。有囊膜
3、的病毒容易被脂肪溶剂破坏。一般常用甲醛等消毒剂来消毒被病毒污染的器皿和空气。,2.2 昆虫病毒的分类,分类依据：形态学特征 囊膜的有无；病毒粒子的形状、大小；亚显微结构等 生物化学和生物物理学特征 核酸类型、核酸特性、蛋白质构成以及隔成分的含量、分子量、浮力密度和沉降系数等 生物学特征 病毒入侵生物体的复制过程、寄主范围和传递方式等,2.2 昆虫病毒的分类,昆虫病毒的类群：根据国际病毒分类委员会（ICTV）1981年通过的分类方案，所有已知病毒分为54个科和群，此外还包括5个建议的或可能的科和群。目前已经明确分类地位的昆虫病毒有11科。,2.3 昆虫病毒的诊断鉴定,一般的形态学和组织学方法：根
4、据染病虫体的症状进行诊断。凡是产生多角体的病毒类型，用一般光学显微镜观察而明确病毒的存在，并可采用某些染色方法来鉴别是哪一类具包涵体的病毒。生物鉴定方法：通过感染试验方法鉴别病毒的存在，比如接种后能引起健虫发生同样疾病。,2.3 昆虫病毒的诊断鉴定,电子显微镜观察 通常包括超薄切片技术、负染色技术和投影技术等。血清学方法 该法可确定各个分离株的亲缘关系，鉴别用一般方法难以区分的病毒。生物化学及分子生物学研究鉴定,3 重要昆虫病毒的概述,到1986年前为止：国内外已从约1100种昆虫、螨类中分出约1690种病毒我国已从约7目26属190种昆虫中分离出234株病毒,3 重要昆虫病毒的概述,已知昆虫
5、病毒的寄主有鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目、同翅目、脉翅目、革翅目、毛翅目、蜉蝣目、蜻蜓目等，尤以鳞翅目为主要寄主。昆虫病毒中的包涵体病约占90以上，其中鳞翅目寄主约为80，双翅目10。在无包涵体病毒中，鳞翅目寄主占33，双翅目23，鞘翅目18，膜翅目2.5,3 重要昆虫病毒的概述,目前已知至少有20余类的昆虫病毒，但研究历史最长、防治应用最广的是杆状病毒科中的核型多角体病毒和颗粒体病毒以及呼肠孤病毒科中的质型多角体病毒。,3.1 核型多角体病毒(NPV),核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis viruse,简称NPV)是研究得最早和最为详细的一类昆虫病毒。
6、到1986年为止，国内外发现464株，中国约124株，其中78株为首次发现。在分类上为杆状病毒属（Baculovirus）的A亚组。,3.1 核型多角体病毒(NPV),一般形态特征：-具有较大的包涵体，称为多角体(polyhedra，简称IB或PIB)，在被感染的细胞核内形成。-多角体大小常因寄主昆虫种类的不同而不同，甚至在统一寄主细胞内，多角体的形状大小也有区别。常见的形状有三角形、四角形、五角形、立方体、不规则形等。,NPV病毒粒子的形态结构,病毒粒子杆状，所以又称为病毒杆状体。病毒粒子由外到内：囊膜（内膜）一层脂质膜 衣壳（内膜）主要成分是蛋白质 髓核由DNA组成，呈螺旋状 后两者加在一
7、起成为核衣壳。在NPV中，通常一个囊膜内由多个排列成束的核衣 壳，称为病毒束。一个品系的NPV，可能每个囊膜内均只有一个核衣壳，也由可能每个囊膜内由1到多个核衣壳而成为“病毒束”，前者称为单粒包埋型病毒，后者称为多粒包埋型病毒。,NPV的理化性状,不溶于水及多种有机溶剂如乙醇、乙醚、三氯甲烷、苯、丙酮等强酸或强碱溶液处理，能使多角体蛋白质溶解。,NPV的理化性状,病毒粒子外有包涵体的保护，可在自然条件下存活多年仍不失效。对低温有较高的忍受力。如家蚕NPV在135150条件下反复冻结融解5次，其感染力不变。对高温的抵抗力较差，如粉纹夜蛾NPV的失活温度为828810min，棉铃虫NPV的失活温度
8、为758010min，粘虫的NPV在100经10min失活。,NPV对昆虫的侵染,感病特征：以鳞翅目为例：感病初期无明显异常变化 行动迟缓食欲减退，体色变淡或呈油光 病虫常爬向寄主植物高处，死前体躯变软 以腹足紧附枝叶倒挂而死 皮肤则脆弱易裂，破后流出乳白色或褐色的 浓稠液体，内含大量新形成的核多角体。,NPV的感染途径,卵期被病毒污染的虫卵在幼虫孵化时因吞食卵壳而感染。舞毒蛾刚孵化出的幼虫常因食人染有LdNPV的卵壳而致死。病死的初孵幼虫又为后期幼虫提供接种源。在幼虫期因LdNPV引起的死亡率常出现两个高潮，一是在孵化后12周，一是在末龄幼虫期。,NPV的感染途径,幼虫被感染后直至出现症状和
9、病征的这段潜伏期受多种因素的影响。接种量少则潜伏期长。幼虫龄期越后易感性一般较小，潜伏期也延长。温度显著影响潜伏期长短，如家蚕在正常室温下57天就出现病征，16 17时15天内不出现病征。较高的相对湿度也能诱发某些昆虫发生病毒病。,NPV的选择性与专化性,杆状病毒曾以选择性和专化性高而著称，但试验证明一种昆虫的杆状病毒能感染其他昆虫的事例并不少见。家蚕NPV能侵染柞蚕等11种昆虫。欧洲云杉卷叶蛾(Choristoneura murinana)的NPV能侵染云杉卷叶蛾(Cfuniiferana)、苹果囊蛾、李食心虫、欧洲松梢卷叶蛾等。红棕灰夜蛾(Sarcopolia illoba)NPV能侵染银
10、纹夜蛾、黄地老虎、粘虫等12种夜蛾科害虫。,NPV的交叉感染性,一种昆虫也可合并感染两类不同的病毒，如黄地老虎、菜粉蝶、粘虫、粉纹夜蛾、云杉卷叶蛾等可合并感染核型多角体病毒和颗粒体病毒。粘虫合并感染NPV和GV时，GV能增强NPV的感染，有协同增效作用。有些合并感染则有干扰作用，如云杉卷叶蛾先感染的病毒妨碍后感染病毒的发展。,3.2 颗粒体病毒(GV),颗粒体病毒（granulosis virus，简称GV）在分类上属杆状病毒科B亚组，是有包涵体的昆虫病毒。目前为止国内外发现GV约130株，中国发现约42株，其中26株为首次发现。,GV的一般形态特征,包涵体称颗粒体(granule)或荚膜(c
11、apsule)。先在被感染细胞的核内形成，但当核膜破裂后可溢出到细胞质内。包涵体很小。在电子显微镜下观察，颗粒体的形状有卵形、椭圆形、长卵形等，通常直径为0.10.3m，长0.31.0m。每个包涵体内一般只有一个病毒粒子。有时也出现不正常的形状。,左图：霜天蛾GV的形态 右图：小菜蛾GV经碱处理后 的病毒粒子,GV的理化性状,不溶于水和一般的有机溶剂如乙醚、乙醇、丙酮、二甲苯等。遇强酸或强碱，包涵体能迅速溶解，并可使病毒粒子变性而失去侵染力。,GV的理化性状,可在室温下保存5年以上而不失侵染力。高温可使其失活。冰冻无多大危害。较低的温度有可能延长贮存的时期。紫外线或其他辐射线能使完整的病毒失活
12、。用稀碱处理后可获得完整和具侵染性的病毒粒子。,GV对昆虫的侵染,感病特征：感染初期无明显病征 之后出现反应迟钝和停止取食 随后虫体颜色发生改变，血液渐变乳白 感病虫体可能膨大或收缩 已死幼虫体壁脆弱，破后流出大量颗粒体。染病幼虫可存活较长时间。病死虫体有时用腹足倒挂枝叶上，呈“”形。,GV的感病特征,染病幼虫常于幼虫期即死，有时也可活至蛹期或成虫期。从染病到死亡所经时间因虫而异。一般45天，可长至34天，如粘虫。幼虫龄期、侵染剂量、温度等因素也能影响这段时期的长短。,GV的感染途径,通过口服进入易感虫体，颗粒体在中肠中溶解，游离的病毒粒子通过肠道柱形细胞的微绒毛而侵入，在这些细胞核中增殖，新
13、形成的颗粒体病毒释放于血淋巴中而导致对其他组织的继发感染。虫体外伤和寄生天敌产卵可引起GV对皮下感染，也可经卵垂直传播。,GV的专化性,颗粒体病毒的专化性较强，交叉感染的情况甚为少见，一般认为颗粒体病毒是包涵体病毒含DNA的各类中专化性最强的一类。以往尚无颗粒体病毒能在植物或其他动物细胞中增殖的报道。近年我国用小菜蛾细胞系BCIRL-Px2-HNU3复制小菜粉蝶GV和用家蚕细胞系Bm-21E-HNU5复制小菜蛾GV成功。,GV的交叉感染现象,鳞翅目幼虫可合并感染NPV和GV两种病毒。如黄地老虎、菜粉蝶、粘虫等可同时感染颗粒体病毒和NPV。粘虫的六龄幼虫如单感染NPV，死亡率3.4，单感染颗粒体
14、病毒，死亡率20%，如二种合并感染，则死亡率为80，死体为NPV病征，体内主要是核型多角体，也有些同时存在颗粒体。,3.3 质型多角体病毒(CPV),质多角体病毒（cytoplasmic polyhedrosis virus，简称CPV）的发现比NPV和GV都要迟。日本蚕病学家石森直人早于1934年就观察到家蚕的中肠上皮细胞内存在有多角体，但当时并未确定是由一种新型病毒引起的。CPV可感染鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、脉翅目5目昆虫，但主要见于鳞翅目和双翅目。到1986年前国内外已发现CPV228株，代表种为家蚕CPV。,CPV作为杀虫剂应用的不多，主要原因是只侵染中肠上皮细胞，在自然界中以
15、慢性感染的地方病出现。如广泛用于生物制剂尚须进一步进行安全试验研究。当前CPV用于害虫防治实践的有日本赤松毛虫(Dendrolimus spectabilis)CPV、。,CPV的一般形态特征,其包涵体和NPV相似，也是多角体，但只在被感染细胞的细胞质内形成。质型多角体呈六角形、四角形、球形、椭圆形等。质型多角体的直径为0.5m25m，1个多角体可包埋10010 000个病毒粒子。病毒粒子为球形二十面体，直径为30nm60nm，有内、外两个二十面壳，每个壳有12个小单位构造。,1 BmCPV的包涵体形态，右下为该包涵体的模式图2 家蚕质型CPV的包涵体形态，右上角为此包涵体的模式图3 扬雪毒蛾
16、CPV的多角体扫描电镜图像4 舞毒蛾CPV包涵体的扫描电镜图像,CPV的理化性状,不溶于水，但在水中经较长时间可被蚀刻，而从表面失去粒子。在碱液中的溶解度比NPV多角体的溶解度为小，如以稀Na2CO3液或其他稀碱液处理，能失去表面病毒粒子，剩下不溶解的多角体，呈多孔的海绵状。在碱液中很快被破坏，在从多角体中分离提纯时须加注意。,CPV对昆虫的侵染,感病特征：早期食欲不振、体躯变小，有时虫体比例不当，头部显得大。中肠中多角体的大量增殖使体色改变为黄色或淡白色等。中肠细胞液化后，多角体可被呕出或由粪便排出。,CPV的感染过程,质型多角体病毒被易感昆虫口服后或将游离的病毒粒子注射入虫体血腔均可引起感
17、染。病毒进入虫体消化道后为碱性消化液溶解而释放出粒子，继而侵入中肠上皮细胞，在其细胞质内增殖，也可传染至前后肠细胞。形成多角体后，有半数以上的病毒粒子不被包埋而游离，释放到细胞间隙，再次感染健康细胞。最后细胞解体，多角体脱落在中肠腔。一般经720天死亡。,CPV的专化性,通常认为质型多角体病毒只感染中肠上皮细胞。一般认为其寄主专化的程度似较多数含DNA病毒者为低。往往能超科感染，从不同寄主所获分离毒株也有同种的可能。,4 昆虫病毒的生产,病毒为专性寄生病原，至今尚未研究出能在人工培养基上生长，只能在活细胞中增殖。因此，目前国内外应用于害虫防治的昆虫病毒制剂主要是通过活虫体增殖和细胞培养法繁殖。
18、,4.1 在昆虫活体中大量增殖昆虫病毒,3种途径：直接在自然种群中繁殖 从野外采回大量活虫接种繁殖 在室内条件下饲育大量害虫接种繁殖 可采用自然饲料或人工饲料。近年来，各种类型的昆虫病毒包括NPV、CPV、GV和昆虫痘病毒等通过人工饲料饲育昆虫而增殖均获得较好的成效。,4.2 在细胞系中大量增殖昆虫病毒,用组织培养增殖的病毒在致病性、专化性及其他特性方面有无变异，尚待进一步研究。同时，因组织培养法要求条件较严格，大量增殖病毒还存在不少问题，目前尚未达到实用阶段。,4.3 昆虫病毒杀虫剂的生产实例,1 核多角体病毒杀虫剂2 颗粒体病毒杀虫剂,4.3.1 核多角体病毒杀虫剂,目前，核型多角体病毒是
19、应用最广泛的昆虫病毒。在中国已进入大田试验的生产示范的核多角体病毒杀虫剂有：棉铃虫NPV、斜纹夜蛾NPV、油桐尺蠖NPV、茶黄毒蛾NPV、舞毒蛾NPV、美国白蛾NPV、杨尺蠖NPV、甘蓝夜蛾NPV等。现以斜纹夜蛾NPV为例，介绍NPV杀虫剂的生产工艺及流程。,斜纹夜蛾NPV杀虫剂的生产,斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科。分布很广，遍及全国，危害植物达99科290种以上，在大田作物中，主要危害棉花、大豆、花生、芝麻、烟草、甘薯、甜菜、玉米、高粱、水稻等，在蔬菜中，主要危害甘蓝、白菜等十字花科蔬菜和水生蔬菜，也危害芋头，苋菜、马铃薯、番茄、辣椒、瓜类、豆类等。,斜纹夜蛾NPV的生产工艺,1 健康斜纹夜蛾幼虫
20、的人工饲养和管理 人工饲料的成分：黄豆粉100g，山梨酸1.6g，麸皮100g，泥泊金1.6g，酵母粉40g，水1000ml，琼脂12g，L-抗坏血酸4g 卵管理：在幼虫孵化前一天，用5福尔马林溶液将卵块浸泡15分钟，无菌水漂洗3次，灭菌纸上晾干，移入盛有人工饲料的塑料盒里，放置25度条件下孵育,1 健康斜纹夜蛾幼虫的人工饲养和管理,幼虫管理：根据以幼虫的生活习性盒饲养密度的要求，把幼虫分为两阶段进行饲养。14龄幼虫饲养密度可为300粒500粒/盒；虫子养到4龄后，饲养密度要适当调小。由于46龄幼虫蜕皮会吐水，造成容器湿度过大，影响生长发育。所以相对湿度也应适度调低。,1 健康斜纹夜蛾幼虫的人
21、工饲养和管理,蛹的管理：将老熟幼虫放入自制的沙营造蛹室（在已消毒的有纱盖的木盒里，放入10cm高的已高温消毒的沙子），待蛹体变黑后，挑取个体大，富有光泽，有活力的蛹，放入产卵箱羽化。成虫管理：将蛹放入垫有湿滤纸的培养皿中，移入纸制养虫笼内，每笼放10对蛹，成虫交配产卵后收剪卵块。,斜纹夜蛾NPV的生产工艺,2 幼虫感染和回收 将饲养至4龄的幼虫，按一定的浓度进行涂毒感染，饲养24小时后换无毒饲料。从感染后的第5天开始收集病死虫。收集的死虫即使处理或放冰箱冷藏。,斜纹夜蛾NPV的生产工艺,3 病毒提取干燥 将病虫尸以1：10自来水混合，倒入电动匀浆机研磨过滤，滤液经差速离心法，离心34次，收集沉
22、淀，浆沉淀按1：1加入填充剂存放20下保存。取冻结的沉淀物机械粉碎，便可获多角体干粉。经显微镜下细胞计数确定含量，存放于4冰箱备用。4 产品的质量检测与药效 含量毒力测定产品卫生性检测产品安全性检测,4.3.2 颗粒体病毒杀虫剂,我国在基础和应用方面研究较详细的颗粒体病毒有菜粉蝶GV，小菜蛾GV，黄地老虎GV，茶小卷叶蛾GV等，其中菜粉蝶GV列入国家“七五”攻关项目进行研究，并完成了中试生产。,菜粉蝶GV杀虫剂的生产,菜粉蝶为世界性重要害虫。其幼虫又名菜青虫，是我国分布最普遍，为害最严重，经常成灾的害虫，幼虫偏嗜十字花科蔬菜，幼虫将叶片咬成孔洞和缺刻，严重发生时可将叶片全部吃光。,菜粉蝶GV的
23、生产工艺,1 人工饲料饲养菜青虫 将菜粉蝶卵于人工模拟产卵卡上孵化后，人工饲料饲养至3龄，大部分用来增殖病毒，小部分继续饲养传代，每代2128天。2 感染回收 将饲养的3龄菜青虫防于特制的塑料篮子中饥饿34小时，将病毒用电动喷雾器均匀喷在菜叶上，喂食菜青虫。一般经过67天后，菜青虫开始感病死亡，及时收集病虫。,菜粉蝶GV的生产工艺,3 颗粒体的提取 经感染的病虫用0.7NaCl浸泡，投入电动匀浆机。将虫浆加入510倍的盐水，电动搅拌机搅拌，用3080目尼龙过滤3次。滤液2000r/min离心30min，收集沉淀。5 拌和、分装 将标定含量的病毒原粉中加入展着剂，粘着剂，保护剂等拌和均匀，定量分
24、装。6 产品质量检验,5 昆虫病毒在害虫防治上的应用,5.1 应用昆虫病毒防治害虫的现状较早应用于森林害虫膜翅目叶蜂类的防治，如欧洲云杉叶蜂、欧洲松叶蜂、斯氏松叶蜂等，在林区应用NPV等可获得较为持久的防治效果。在鳞翅目森林害虫中，利用病毒防治有效的实例也不少。如舞毒蛾，天幕毛虫、松毒蛾、松带蛾等林木害虫。目前大约已有50余种昆虫病毒进行过大田防治试验。,我国约有20种昆虫病毒进行过或正在进行大田试验。其中研究较多应用较广的如棉铃虫NPV，用该种病毒防治棉铃虫，每667m2用感染病毒的老龄死虫230头(核型多角体数约为0.156l011)对水喷雾，在棉花生长期发生害虫时每隔45天喷1次，共喷9
25、次，棉花产量比对照区显著增产。美国应用棉铃虫NPV的制剂防治棉花、玉米、高梁、烟草、番茄等作物上的棉铃虫和烟草夜蛾等害虫的效果一般相当于常用化学农药。,加拿大研究菜青虫的黄绒茧蜂能在寄主种群中传播GV。美国研究于甘蓝幼苗移植时以粉纹夜蛾NPV污染幼苗，能在整个生长季节维持较高病毒浓度并向周围传开，84天后未处理区植株上幼虫死亡率竟高达89。椰犀角金龟子(Oryctes rhinoceros)种群密度不高时(25头hm2)散布独角仙杆状病毒(C亚组)，活动的成虫传播病毒每月可达3km，5个月后该虫种群中病毒病发展到流行水平。,利用病毒防治害虫一方面可以起到微生物杀虫剂的短期防治作用，另一方面使用
26、后有可能使病毒长期存在于农林生态系中，作为一类被引入的生态因子而起调节害虫种群密度的作用。常规方法施用或释放带毒昆虫散布一定限量的病毒后，病原可在昆虫种群间自行传播。毒饵剂和散布带毒虫体具有较高的经卵巢传播的潜力，其他昆虫或寄生物和捕食者有机械传播病毒的潜能。,5.2 局限性,昆虫病毒对害虫的防治也有其局限性，如感染的潜伏期较长，一般从感染到致死需714天或更长时间，由于专化性较强，杀虫谱性较窄。如仅用于短期速效性防治，在经济上和当前所获效果上不如高效低毒的化学农药，如从害虫综合治理要求考虑，利用病毒防治害虫具有重要的意义和前途。,谢谢大家！,5.2 影响病毒防治害虫效果的环境因素,温度 温度
27、可影响发病潜伏期的长短，NPV和CPV等的传播适温约为25，如将温度从15提高到32，可减少棉铃虫(Heliothis zeae)NPV对该虫的LT50从9到23天，减少LT80从29到11天。,(二)光线 紫外线对病毒的致病力有影响。在田间条件下，特别是用飞机喷洒病毒悬液的情况下，日光照射能影响制剂的效果。室内试验距紫外线源5cm，5min可使实夜蛾属(Heliothis)的NPV全部失活，可使粉纹夜蛾的NPV在2h内全部失效。田间GV制剂在日光暴晒的甘蓝叶面经1219h全部失效。昆虫病毒制剂在田间的失效与日光特别是紫外线的关系最大。制剂中加用紫外线保护剂或其他辅剂可延长滞留而有助于增效，,
28、(三)pH和土壤 病毒的活性与其繁殖环境的pH有关，实夜蛾属的NPV在pH为2时经30min或pH为12时经24h活性大减。棉铃虫的NPV最好保存在pH为7的条件下。病毒在土壤中有相当高的稳定性，施于土壤内的NPV制剂在231周内数量可无减少，粉纹夜蛾的NPV在土壤内可保持活性达5年之久，不受雨水冲刷的影响，也不受正常pH和微生物分解作用的影响。因此，土壤成为这类病毒的贮存源，并可污染作物叶面，引起害虫种群内病毒病的流行。,自然条件下的爆发,在自然条件下，昆虫病毒病的发生常有突然暴发的现象。有人认为虫体内本有潜伏病毒，一旦遇有一定的外因激发，便能诱导发病。第二种病毒的介入往往也可能促发潜伏病毒
29、病。,主要内容,前言研究目的及意义研究现状研究内容及可行性技术路线研究时间计划安排,灰白蚕蛾Ocinara varians Walker属鳞翅目，蚕蛾科昆虫，分布于广东、广西、四川、台湾、海南等地，在华南地区危害小叶榕、黄葛榕、高山榕、菩提榕、木波萝等主要园林树木，是一种主要的园林害虫。近年来，其为害日益严重。,13龄幼虫取食叶肉，致叶片只剩下网叶脉，被危害叶片不久呈深褐色。4龄后的幼虫取食叶片呈空洞或缺刻。末龄幼虫食量大增，食光叶片及嫩梢，仅余树干。,研究目的及意义,灰白蚕蛾是一种近年来为害比较严重的园林害虫，而在对灰白蚕蛾的防治上以化学防治为主，使用的农药主要是拟除虫菊酯类农药。化学农药的
30、长期使用，不仅使害虫容易产生抗药性，而且大量杀死天敌，污染环境，危害居民的身体健康。其结果是消弱了生物防治的作用，更加凸现了3R问题的严重性。,研究目的及意义,昆虫病毒作为生物防治中的一种，在近年来被多次证实是效果比较显著的方法之一。通过对灰白蚕蛾核多角体病毒的研究，了解其生物活性、探讨使用该病毒防治灰白蚕蛾的可能性，为杀虫剂的生产及其应用提供一定的依据。,研究现状 灰白蚕蛾核多角体病毒 Ocinara varians Walker nucler polyhedrosis virus 属杆状病毒科、杆状病毒属、A亚组（苏星等，1983）。有关灰白蚕蛾核多角体病毒的研究，据目前手中掌握的资料显示
31、，在1983年林业科学的昆虫集刊中，苏星发现并命名了此病毒。但未见有人对其进行系统性研究。,研究的具体内容,1 灰白蚕蛾核多角体病毒的分离和鉴定 2 灰白蚕蛾核多角体病毒毒力的生物测定 3 不同虫龄幼虫对灰白蚕蛾核多角体病毒的敏感性 4 温度、光、pH值对病毒活性的影响 5 感染灰白蚕蛾核多角体病毒的幼虫发育与温度的关系,独创及新颖之处,首次对灰白蚕蛾核多角体病毒进行系统性的研究，明确该病毒的致病力，为在田间应用防治灰白蚕蛾提供科学依据。首次提出利用昆虫病毒来防治园林重要害虫灰白蚕蛾，填补了关于该虫在生物防治方面研究的空白，为灰白蚕蛾的综合防治开辟新道路。,已做过的前期工作,1 已经熟练掌握灰
32、白蚕蛾的饲养技术以及灰白蚕蛾核多角体病毒分离提取技术2 目前对灰白蚕蛾多角体病毒外部形态特征已有初步了解3 第一部分已经完成，已经抽提了病毒原液，并确定了其浓度4 生测部分正在进行中,技术路线,研究时间计划,1 灰白蚕蛾核多角体病毒的分离和鉴定（）2 灰白蚕蛾核多角体病毒毒力的生物测定（）3 温度、光、pH值对病毒活性的影响（）4 不同虫龄幼虫对灰白蚕蛾核多角体病毒的敏感性（2006.8-2006-9）5 感染灰白蚕蛾核多角体病毒的幼虫发育与温度的关系（）,1 灰白蚕蛾核多角体病毒的分离和鉴定,病症：染病幼虫食欲减退，行动迟钝，发育缓慢，进而体节肿胀，体色由灰褐色变为黄褐色或深褐色，在后期病虫
33、常往上爬，最后以腹足倒挂在植物或养虫器材上死亡。死亡后，皮肤微触即破或自行破裂，流出黄白色的体液，体液内充满多角体。,1 灰白蚕蛾核多角体病毒的分离和鉴定,1.1 病虫的收集 将采集的自然罹病灰白蚕蛾死虫（经预备试验回感灰白蚕蛾幼虫获得同样的病原体，符合病原微生物的柯克定律）经粗步提纯，感染健康幼虫，待感染发病后，取濒死幼虫，并观察病征。,1 灰白蚕蛾核多角体病毒的分离和鉴定,1.2 核多角体病毒的分离提取1.3 核多角体病毒的电镜观察,2 多角体病毒毒力的生物测定,试验方法 将供试毒源稀释浓度依次为5个浓度（待定），分别将大小基本一致的黄榕叶片浸入上述5种浓度的病毒液中（对照组浸入清水）；上
34、述黄榕叶片晾干后，放入饲养幼虫的罐头瓶里，每罐5头，每个浓度处理10罐。在室内平均温度2528度条件下饲养灰白蚕蛾幼虫。待灰白蚕蛾幼虫取食完叶片后，更换新鲜无毒黄榕叶片。随后每24小时全部更换新鲜叶片，并记录检查供试幼虫死亡数、死亡原因。,3 不同虫龄幼虫对灰白蚕蛾核多角体病毒的敏感性,试验方法 经预备试验后，取具代表性的两个浓度梯度（待定），分别于幼虫的15龄的中期，以浸叶法进行饲毒，每处理使幼虫饥饿6h，饲毒24小时后，改为新鲜的黄榕叶片饲养，以5头幼虫为一组，集体饲养于罐头瓶中。每天在定时更换叶片的同时，观察记载幼虫的死亡数、发病数、发育历期等，直至幼虫化蛹或死亡。饲养条件均为室温，25
35、28度，相对湿度5070。,4 温度、光、PH值对病毒活性的影响,2.1 温度试验方法2.1.1 多角体悬液水浴处理 设30、40、60、80、100度5个处理，将病毒悬液盛于烧杯中，在水浴锅中加热，用温度计不断搅拌病毒液并观察温度，待达到该温度时，使其保持恒温15分钟后取出冷却供试。2.1.2 干多角体烘箱处理 设40、60、80、100、120度5个处理。取0.5ml病毒原液滴入培养皿中摊平呈薄层，自然晾干后，用恒温箱分别在不同的温度下恒温处理15分钟和60分钟，取出冷却后，用蒸馏水洗出多角体，稀释成一定浓度的病毒液供试。,4 温度、光、PH值对病毒活性的影响,2.2 光照试验2.2.1
36、干多角体日光照射 涂有干多角体薄层的培养皿分别在强光下照射0、4、8、16、32小时后供试。2.2.2 干多角体紫外光（灯）照射 将涂有干多角体薄层的培养皿放在20W紫外灯下，培养皿距紫外灯25cm，经不同时间（0、0.5、1、2、4、8小时）照射后分别取出供试。,4 温度、光、PH值对病毒活性的影响,2.3 PH值试验 按不同比例的柠檬酸和NaH2PO4溶液配制成不同PH（2、4、6、7、8、10、12）的缓冲液，各取100ml于小盐水瓶中，加入病毒100亿PIB，充分摇匀，即成含1亿PIB/ml的不同PH值病毒液，在室温下保存1个月分别进行毒效测定。,5 感染幼虫发育与温度的关系,试验方法 取灰白蚕蛾新产卵块,以10%甲醛溶液浸泡消毒并冲洗干净，孵化后用干净黄榕叶片饲喂至4龄和5龄。准备5个恒温箱，分别为20、25、30、35，及40。日光灯（40W，2支）照明，光照时间14h/d，每箱内置1个水盘，保持相对湿度50%70%。取病毒原液，以10倍稀释法配制5种浓度（待定）的多角体悬浮液备用。每个温度、每个浓度供试20头3龄幼虫，单头置入培养皿中，皿内置浸入病毒液的干净黄榕叶片。另设无菌水涂叶的对照组。首先使幼虫饥饿6h，取食24h后，以无病毒的干净黄榕叶片饲喂。逐日记载各瓶的虫龄、显症时间、病死时间及黄榕取食量等，并抽样镜检。对5龄幼虫，试验方法与4龄相同。,
