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1、,第六章 微生物的生长 繁殖及其控制,第一节 微生物生长的测定,微生物生长的概念及常规测定方法（原理和操作）,第二节 细菌的群体生长繁殖,细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）及控制技术（连续培养的概念和方法）,各种常见物理、化学因素对微生物生长的影响,第三节 微生物生长繁殖的控制,生长：,繁殖：,细胞物质有规律地、不可逆地增加，导致细胞体积扩大的生物学过程。,微生物生长到一定阶段由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,参见P132,生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低
2、等特别是在单细胞的生物里，由于个体微小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。,参见P132,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例生长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加,群体内各个个体进一步生长,群体的生长,群体生长=个体生长+个体繁殖,微生物生长：,在一定时间和条件下，细胞数量的增加,（微生物群体生长）,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。,大肠杆菌一个细胞重约10-12克，平均20分钟繁殖一代,24
3、小时后：4722366500万亿个后代，重量达到：4722吨48小时后：2.2 1043个后代，重量达到2.2 1025 吨,相当于4000个地球的重量,一头500kg的食用公牛，24小时生产0.5kg蛋白质，而同样重量的酵母菌，以质量较次的糖液（如糖蜜）和氨水为原料，24小时可以生产50000kg优质蛋白质。,第一节 微生物生长的测定,微生物生长的概念及常规测定方法（原理和操作）,微生物生长：,单位时间内微生物数量或生物量（Biomass）的变化,重量测定生理指标测定,参见P151,一、计数法,参见P152,通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。,1、培养平板计数法,
4、对样品进行适当稀释,单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖,肉眼可见的菌落,对菌落数目计数推测样品中的微生物细胞数,由于无法保证细菌细胞在分离过程中彻底分开，因此，一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数（个）。,菌落形成单位（colony forming units，CFU）：采用菌落计数时，由于不能绝对保证一个菌落只是由一个活细胞形成，计算出的活细胞数称为CFU。CFU并不完全等同于样品中的活菌数。,采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果；,样品充分混匀；
5、,每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复，取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；,2、膜过滤培养法,如何对菌数低的样品，如水，中的细菌数量进行计数？,参见P153,水中细菌总数：124 cfu/100ml,3、显微镜直接计数法,利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,参见P152,1）常规方法,缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对较高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。,2）其它方法,比例计数:,已知浓度的样品（如血液）+待测浓度的样品；显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生
6、物细胞浓度。,过滤计数:,活菌计数:,采用特定的染色技术对活菌和死菌分别计数,二、生物量测定,1、比浊法,在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（optical density，即O.D.）表示菌量。,测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的范围内，否则不准确。,参见P153,2、重量法,以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸的测定间接推算微 生物群体的生物量。,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,参见P153,3、生理指标法,参见P154,生理指标：,呼吸强度耗氧量酶活性生物热,等，与其群体的规模成正相关,第二节 细菌的群体生长繁殖,细菌生长繁殖的规律（标准生长曲
7、线）及控制技术（连续培养的概念和方法）,参见P134,微生物的特点：,个体微小,除真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个微生物组成的群体。,微生物的接种是群体接种，接种后的生长是群体繁殖生长,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,参见P134,一、生长的规律,在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。,生长曲线（growth curve）：,细菌接种到定量的液体培养基（封闭系统）中，定时取样测定细胞数量，以时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养 期间菌数变化规律的曲线,细菌的生长曲线一般以菌数的对数为纵坐标作图,1、迟缓期,将少
8、量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加或增加很少，生长速度几近于零，也称延迟期、适应期,迟缓期细胞的特点：,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末细胞的平均长度比刚接种时长6倍。通常处于迟缓期的细菌细胞最大。细胞内RNA，尤其是rRNA含量高，合成代谢活跃。核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。,分裂迟缓，代谢活跃,以上特征说明，细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,迟缓期出现的原因：,调整代谢,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏能量和必需的生长因子，“种子”老化（即处于非对数生长期）或未充分
9、活化，接种时造成的损伤等。调整代谢需要一段适应期。,迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄及移种前后所处的环境等因素有关，有的只需几分钟，有的需要几小时。,在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：,通过遗传学方法改变菌种的遗传特性利用对数生长期的细胞作为“种子”尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大适当扩大接种量,2、对数生长期,也称指数生长期（exponential phase）,代时（generation time）：在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间，通常以G表示。倍增时间（doubling time）：在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间。,参见P137,t t 0 G=3.
10、322（lg Nt lg N0),影响微生物代时的因素：,1）菌种，不同的微生物及同一微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短；,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度成正比；,4）温度，在一定范围内，生长速率与温度成正相关；,在一定范围内，生长速率与温度成正相关,参见P149,不同的微生物有不同的最适生长温度范围,3、稳定生长期,又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活菌数量最高并维持稳定。,（细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量）,对数期到稳定期的转变是细胞重要的分化调节阶段：1）开始储存糖原等内含物 2）形成芽孢或建立自然感受态（芽孢杆菌）3）发酵
11、过程积累代谢产物的重要阶段 某些放线菌抗生素的大量形成也在此期,稳定期的长短与菌种和外界环境条件有关,生产上延长稳定期的方法：补充营养物质（补料）或取走代谢产物 调节pH、调节温度 对好氧菌进行通气、搅拌或振荡,获得更多的菌体物质或代谢产物,营养物质耗尽或有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。死亡的细菌以对数方式增加，但由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡速率降低，在衰亡期的后期仍会有部分活菌存在。,4、衰亡期（decline或death phase）,衰亡期的特点：细菌代谢活性降低；细菌衰老并出现自溶；产生或释放出一些产物，如氨基酸、抗生素、外肽酶等；菌体细胞
12、也呈现多种形态，有时出现畸形，细胞大小悬殊。有些革兰阳性菌此时染色呈革兰阴性。,不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用（如葡萄糖或NH4+等）；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两种碳源（或氮源）时，微生物生长过程中会形成二次生长现象。,二、同步培养,理想的实验材料：,群体细胞能处于同一生长阶段，同时进行分裂的生长。,同步生长,同步培养（synchronous culture）：,使群体中的细胞进行同步生长的培养技术,通过同步培养的方法获得的细胞
13、称为同步细胞或同步培养物,参见P138,机械法,环境条件控制技术,离心法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法,温度培养基成分控制其他（如光照和黑暗交替培养）,同步培养物：一种理想的材料,生理与遗传特性研究工业发酵的种子,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐演变为随机生长。,三、连续培养,将微生物置于一定体积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。,分批培养（batch culture）或封闭培养（closed culture）,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,迟缓期、对数期稳定期、衰亡期,连续培养（continuous culture）,在微生物的整个培养期间，通过一定
14、的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,在培养过程中不断地补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。,控制连续培养的方法,恒浊器连续培养,恒化器连续培养,不断调节流速，使培养液浊度保持恒定,保持恒定的流速,（一）恒浊器连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的速率,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度上升；,恒浊器培养的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌
15、体维持最高的生长速率。,一般用于菌体以及菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,（连续发酵）,连续发酵与单批发酵相比的优点：,缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,（二）恒化器连续培养,使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下生长进行繁殖。,恒化器连续培养中，必须将某种必需的营养物质控制在较低浓度，以限制生长速度，而其他的营养物质均过量。,细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率。,限制性因子必须是机体生长必不可少的营养物质，如氨基酸、铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源，或者是无机盐
16、、生长因子等物质。因而可在一定浓度范围内决定该机体生长速率。,通过控制流速可以得到生长速率不同但浓度基本恒定的培养物,主要用于：科研,遗传学：突变株的分离生理学：不同条件下的代谢变化生态学：模拟自然营养条件建立实验模型,第三节 微生物生长繁殖的控制,各种常见的物理、化学因素对微生物生长的控制（原理和方法）,抑制（inhibition）：生长停止，但不死亡；,死亡（death）：生长能力不可逆丧失；,防腐（antisepsis）：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长；,消毒（disinfection）：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；,灭菌（sterilization）：杀死包括芽孢在内
17、的所有微生物；,化疗（chemotherapy）：杀死或抑制宿主体内的病原微生物或病变细胞；,参见P160,控制微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。,理化因子是抑菌还是杀菌作用的相关因素：,理化因子的强度或浓度同一浓度理化因子作用时间的长短不同种类的微生物同一种微生物不同生长时期,参见P154,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂抗代谢物抗生素,控制微生物的化学物质,1、抗微生物剂,一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质,化学物质的抗微生物能力的测定,液体培养法,平板培养法,最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MI
18、C）实验,抑菌环/圈（zone of inhibition）实验,杀菌？抑菌？,通过这两种方法无法区分抗微生物剂的作用效果,抑菌剂（bacteriostatic agent）杀菌剂（batericide）溶菌剂（bacteriolysis）,消毒剂（disinfectant）防腐剂（antiseptics）,防腐剂与消毒剂,特点：对一切活细胞都有毒性，不能用于人或动物体内的化学治疗。,消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。,防腐剂：可杀死微生物或抑制其生长，但对于动物或人体的组织 无毒害作用，可作为外用抗微生物药物。,使微生物蛋白质凝固变性,如酒精等；破坏菌体的酶系统,如过氧化
19、氢等；增加细胞膜的通透性,使细胞发生破裂或溶解.如来苏儿等酚类物质。,作用机理：,消毒剂广泛用于一些热敏感的或无法进行高温灭菌的物品或场所的灭菌。,温度计、带透镜的仪器设备、聚乙烯管或导管等；墙壁、楼板、仪器设备等表面和自来水；空气,防腐剂通常作为人体的外用品！,各种抗微生物剂杀菌能力的比较标准：,在临床上最早使用的消毒剂石炭酸,一般规定：处理时间为10分钟，供试菌为 Salmonella typhi（伤寒沙门菌）,由于各种抗微生物剂的杀菌机制各不相同，故石炭酸系数仅有一定的参考价值。,2、抗代谢物（antimetabolite）,叶酸对抗物（磺胺）、嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）苯丙氨酸对抗物（
20、对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶对抗物（5-FU）胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）,磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学治疗剂，抗菌谱广，能治疗多种感染性疾病。,大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎链球菌、溶血性 链球菌等）某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、流感杆菌等）对放线菌也有一定的作用,1934年，德国染料厂的G.Domagk,一种红色染料（prontosil），白鼠静脉注射，可治疗链球菌感染，但在体外无作用。1935年，进一步证明protosil对人链球菌感染也有效。,1935年除，Domagk唯一的女儿因伤口感染濒于死亡，在绝望中Domagk将尚未经过临床试验的prontosil注射到女儿体内，结果挽回
21、了女儿的生命。,法国人Trefuel和英国人Fuller证实：在体内prontosil转化成了具有抑菌作用的磺胺。,作用机理：,磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶二氢叶酸合成酶，不能用外界的对氨基苯甲酸合成叶酸，必须直接利用叶酸作为生长因子进行生长。,3、抗生素（antibiotic）,抗生素：某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。,自上世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅有几十种。,1）作用机制：,抑制细菌细胞壁的合成 破坏
22、细胞质膜 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化 抑制蛋白质和核酸的合成,抑制微生物的生长或杀死它们,青霉素的-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法相互连接，抑制了细胞壁的合成。,由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的抗生素抗菌谱各异。,2）细菌抗药性的产生,抗性菌株的特点：,细胞质膜透性改变，使抗生素不能进入细胞或进入后被细胞主动排出；,药物作用靶改变；,合成了修饰抗生素的酶；,抗性菌株发生遗传变异，导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体；,一、控制微生物的物理因素,温度辐射作用过滤渗透压干燥超声波,1、温度,当温度
23、超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。,温度愈高，十倍致死时间愈短,高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。,D值大小还与微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等有关。,高温的杀菌时间与样品中的微生物浓度有关。,当微生物的浓度一致时，可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感性。,1）干热灭菌,烘箱内热空气灭菌火焰灼烧,160,2h,2）湿热灭菌,湿热比干热灭菌更好：,更易于传递热量；更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构,湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：,多数细菌和真菌的营养细胞：在60
24、左右处理5-10分钟；酵母菌和真菌的孢子：用80 以上温度处理；细菌的芽孢：121 处理15分钟以上。,（1）巴斯德消毒（pasteurization）,（2）煮沸消毒,（3）间歇灭菌（fractional sterilization OR tyndallization）,（4）常规高压灭菌（autoclaving）,（5）连续加压灭菌（continuous autoclaving）,135-150，5-15秒，工业上发酵培养基135-150，2-6秒，牛奶或其它液态食品,（超高温灭菌）,60-85 处理15秒至30分钟,121，15分钟115，30分钟,2、过滤作用,空气和不耐热的液体培养基的灭菌,3、辐射作用,辐射灭菌（radiation sterilization）是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物体上的微生物的一种有效方法。,4、高渗、干燥、超声波等,THANKS！,非选择性,选择性,（对所有细胞都有毒性）,（对病原微生物毒性强）,消毒剂（disinfectant）防腐剂（antiseptics）,抗代谢物抗生素中草药有效成分,化学治疗剂,
