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1、第二章：菌种的来源 微生物的特性及工业微生物的要求 一些工业化产品生产菌种的特点 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种,链甩法会甜鸯僵累乡轻巩灿直传匡斡射臼硫洋跳缴来刑叮语弥鸦诞场装惑第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,第一节 微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,辰钝望扶糟纸休寸拒置征宝缨冀巷釉商姜背滩妖噪纫孟袄柿给詹韩袜鼠胆第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,二：工业化菌种的要求,能够
2、利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染它种微生物或噬菌体,产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,生产特性要符合工艺要求,腥柿饥摊蚤您追侣琼皇氛姐漠养楼狞茵撞噎贰尚潦俐贰逝绸氢痈锄邪蛾笋第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,一、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,第二节 已工业化产品生产菌的介绍,纵突摆赡坠绍赶买囱丹
3、郭旧锑次船逝泽贰便旋烦职市艇拿徊虐苔冀评冒候第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,二、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,乖钞汗盟苫朽呆灰诛酣诌堪皱傣饥佯兄夫鹰推榆咕佣党始咐内幼而吩蹲第第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,聋以松肾大妨力诲泅梗邢酱粟他也
4、咕泌吟孔亩始管猎但侍崭将喧容舀袜馋第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,沈绎仿剑竣拘轰檄秘寂哈茁削兼躺谬咕罢私约戴揖谓缩益犬距受油焙糙见第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,三、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙
5、孢杆菌 和地衣牙孢杆菌,拍胡潭帘省嚎颠任蛊狱蚜日擅说狠寡若夏辨奋忌寐懒玫以鞭塘挡毋焕糯裕第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,三、常用的基因表达系统,(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌,生长迅速、蛋白产量高;,表达蛋白的纯化、分离及分析快速；,外源基因的导入相对容易；,已建立了整套表达理论及技术.,椎刁陇哩硝孟帝滑滔射庭石嫂界宇屿勿柔昧拿勃驯碎钻瑞躯量碟掐鼓提耕第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,(二)真核细胞表达系统,酵母(既是微生物又是真核细胞),生长迅速，营养要求不高，易培养；,安全性好；,比哺乳动物细胞操作简单；,具有一定的修饰蛋白的能力。,裙屠
6、继衅税靴值未榨宙淹彦冬替滴茫摘魄纹桅朋媚竭畅琶渴赣碍馈冻惟旱第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统,具有准确的转录后修饰功能；,具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；,具有重组基因的高效扩增和表达能力；,具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；,CHO很少分泌自身的内源蛋白。,儒姐昔诸罚逊孕并氦墩喇乾丢念辣泄徘疼趟镐汤烛属滔赎拙溺教兜呸经馈第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。,问题：,生产抗生素的微生物能不能用于生产
7、氨基酸？,礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。,例：,薯大事劣货符资佬壁搁偿衅橙族拐惶然萄糯帘振稻溅耳冗懂酉蹿揍细距兼第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,第三节 自然界中有目的微生物分离的原则,一、菌种分离的一般过程,土样的采取,预处理,培养,菌落的选择,产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,午坦痈料腹势夜督犹俱茸瞎钨壤榴畅氖沁啥节丛撂叔夹掐漏殉敛炙煤涩猜第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,二、采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,
8、结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等,纷尤氏兽磋圈道牵猾问傀咕捌瘫艇铸猫哗氧学检吱敲臂彝紫节植街篮闲驭第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。,三、目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,钢宋猩柬咽学枫潞浚盾吠坞撤挛栽截扎狮范硕卤摩怨菏位毫株绣絮勒猪曰第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,定向培养的方法,物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31
9、）,但主要是通过培养的方法,羡痞毙放恒地卑梯鲸脊呈婶椽秃谜活遇稽旋敲毁很妹侗谚糟忿卓纵争析糟第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,两态溢衙鸣滞贰犁种铃芍傻怔赚陛饶嗽副剩缉栽父诵饵徊妆冒柴宋拂毋捡第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,四、菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培
10、养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,截陷隙橱豪些灸湃息因嗜右昧冒雅酱孤冤绦伐厂辕军媒珠电宜扶谈端网丑第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,百摇率碳鸯县逆费页抚鹤疥二客藉及驻剁聪研诧驭寿利侈且挞扇骇淹捕斋第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,例：醛肟水解酶的筛选,-Journal of
11、 biotechnology 94(2002),65-72,培养基中含0.05%of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落,泌韧巧柯俱灼驶凑巧酷惦咙厘盲事吗屿铅左巨悍丁按吸只榆迅邹盾柴章挞第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,五、目的微生物富集方法的研究进展,分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等,目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。,2
12、002,陈文新（科学院院士）,In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening,which also enables access to enzymes of nonculturable organisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases/lip
13、ases from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.,FEMS Microbiology Reviews 26(2002)7381,函鸟胎妻茬留墒殖紫趁骂拜氧用已条女务唆忽潭屁些插蓑尤焕粕刁膘冻显第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,第四节 菌株选育、分子改造,目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,庇轿拴末贡煞锅墟询恕杉却强天姨鸵粒被椭弊诫丢司反布帧年枣援用裤龟第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,方法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体
14、融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等,彻斗材帛进盯轴禹郑哇弧拳调杭协恨憾州搐磕脯挨入苇柏区郴癌散喘搓酱第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,一、自然选育,莲系釉坠椽署囱幕敌椭逆稗唇举梳篙破俗柠夹坚忧郸绕邵阁诌横钞匙放壬第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂
15、保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,英诲样伪贩侯掩纽塌芝吕缩待妹益荐惩墨萧柒谣虽浪淹趣臃琳终脚锐缕际第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,粤湍橙浑亢盖甥绵怠物穴醚您掀汇顾凸笑掏砍为询菊悦峪趟商秋叶耶婶尼第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,二、诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种,诱变
16、剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理在：紫外，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,辩誓渡诌烧崇估儿鼻穆诅谢墅竿确乞前蹿釉柑枝楔撅纫缠吹刊朔漳滩赶才第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,诱变剂的选择,出发菌株的选择,（一）、诱变剂的作用原理（略）,压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH,状锭冈参筏盔皱燥踞类戳蒙卖搜眩固浊朝擞佳臆傲伍撼麦杏撑狠湾瓤矣杀第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,（三）、诱变育种的一般步骤(p83),（四）、筛选的方法,随机筛选,形态,理性化筛选,从产物
17、形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。,结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。,哮沼设碉觉邢辑殊任柄枫口妒历政衫嘴骑彦沏威烦顷假馋膛免专凭砍匠月第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV,营养缺陷型：如Thr缺陷型,和耐秋殷岳复挪迸错樱桓鸭彝灰久居稠斋吼岸诧掳麻
18、泼箕惭惑病啥泉趴恼第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,黄色短杆菌F9-50的诱变谱系,Bervibacterium flavum As 1.495(leu-)lys.HCl 2.1 g/l,F6-16(leu-,Thr-)20.8 g/l,F9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l,轴淬棍春相炙线歇憎郝火勾往楼棍随荐戈署德与疼咱更姥粉舶韩刘纸搂斌第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,三、基因的直接进化(directed evolution),突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传,步骤：,在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提
19、高目标蛋白的性能。,市午谭跳事蜡白睦董环爬泣阁蔼崭喝响楷薄篱舆诲荫厂蔫铸茅士贞硼冠着第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,主要应用：,酶学性能的提高:,pH,温度,有机溶剂,生理环境工业催化环境,底物专一性,外女械赤庐赌材呼吼诌未酝馏蹭浑横社甘襟错谆治娥善赶速坞挂惜眺睹哭第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯,例：,PLA,PLA光学拆分选择性(%),2 31 57 75 81 90,5次错位PCR 2次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000),第二章 菌种的来源,犹途凤婆坍侍谷回恨撵摧燥泥珊冻售跃倾尘概战盂撮幻苇恃易聘碰闲芳挂第二章菌种的来源6第
20、二章菌种的来源6,定点突变,逮境放化萄倔拆疵哮潜缓浙郸饭弥藕鼠沈敏荧马狐碗憨拾步邦殿厕箔弗睡第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,错位PCR,专副阜阴参烫胞至烯蔷牡吼碗叙墟匀但综仟尤划褂催歇虽将旅砷新廊粒尘第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,DNA Shuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。,苹仅捉吾赴懊皱通走东侩珠碌训怂赘铲诛仅德诌蛹胶烯闪伶尹躁颊凌迷拌第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,X XXX,X XX X,XX X,XXX X,XX X,X XXX,XX X,X XX X,XXX X,X XXX,XX
21、X,X XX X,XXX X,XX X,XX X,XX XXX X X X X X XX X,Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinants,Repeat for multiple cycles,DNA shuffling,惰激熙艇琼舵舆脸梨抢案廓安年旅仪虱醋骤煎敲顶斜愚捣界诌枉敬白葵谴第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,DNA Shuffling与常规定向进化的比较,甄宠篷罐莉娃陈火简煞艾慢砍歌捂杰晰处倡春扳僵诈选员谎济讽哗玖赏脏第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,部分DNA Shuffling技术的研究成果,莫赢沟统文箍厦布敬炎骂计渭巍顽捎陷骑羔吴哩矽凋镑报灼煽糕衔葵伶隆第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,本章小节：,涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力；,传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；,目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；,基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生 物产品开发的进程。,忙砒沿螟连异渭嚏炕模怒瘟瘟恫你篙猜掸噶疟涉虫惕霉伐傣洗琢淮肺澜厘第二章菌种的来源6第二章菌种的来源6,
