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1、左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂的评价高永良王晓青李敬来(军事医学科学院毒物药物研究所 北京100850 )摘要目的：对制备的左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂进行安全性和药代动力学 评价，比较鼻喷剂和片剂的生物利用度。方法：用大鼠鼻黏膜形态学检查评价局 部刺激性，蟾蜍上颚黏膜纤毛为模型考察纤毛毒性。LC/MS/MS法测定给药后两 种制剂在比格犬体内的血药浓度，对药时曲线进行模型拟合，计算药动学参数和 相对生物利用度。结果：左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂对大鼠鼻黏膜刺激性及其纤毛 毒性较小，鼻喷剂和片剂在比格犬体内均符合二室模型，鼻喷剂的 Tmax为(15.788.65)min，比片剂约快 5 倍，Cmax 为(1
2、0.003.66)ng-mL-1，约是片 剂的4倍，对片剂的相对生物利用度为(23179)%。结论：左旋盐酸苯环壬酯 鼻喷剂局部用药较安全，起效迅速，相对生物利用度高，具有很好的应用前景。 关键词左旋盐酸苯环壬酯；鼻腔喷雾剂；局部刺激性；纤毛毒性；LC/MS/MS 法；药代动力学；相对生物利用度STUDY ON A NASAL SPRAY DRUG DELIVERY SYSTEMCONTAINING L-PHENCYNONATE HYDROCHLORIDEGao YOng-liang, Wang Xiao-qing, Li Jing-lai(Institute of Pharmacology
3、and Toxicology, Academy of MilitaryMedical Sciences, Beijing, 100850)ABSTRACT OBJECTIVE: To study the security ,including mucous membrane irritation and ciliotoxicity, and pharmacokinetics of a nasal spray drug delivery system containing L-phencynonate hydrochloride and compared with the tablet on b
4、ioavailability. METHODS: Mucous membrane irritation test of rats was carried out by studing the structural and specific cellular changes of nasal mucosa after administering the spray. “toad palate mucoas method” was used to assay the ciliotoxicity of the spray. Finally, in vivo study was carried out
5、 with beagle dogs to investigate pharmacokinetics and bioavailability of the nasal spray. RESULTS: The influence of the spray on cilia structural and specific cellular changes of nasal mucosa showed together that the ciliotoxicity of the formulation was low and reversible. The results of pharmacokin
6、etic study indicated that nasal spray fit with two compartment model in vivo with Tmax （12.52.74）min and Cmax （10.003.66）ngmL-1, respectively 5 times and 4 folds or so higher than conventional tablets. The relative bioavailability of nasal spray was （23179）%, compared with conventional tablets. CONC
7、LUSIONS: The nasal spray of L-phencynonate hydrochloride developed in this study was confirmed with little ciliotoxicity, quick absorption and higher relative bioavailability. KEY WORDS L-phencynonate hydrochloride; nasal spray; mucous membrane irritation; ciliotoxicity; LC/MS/MS; pharmacokinetics;
8、bioavailability盐酸苯环壬酯是军事医学科学院毒物药物研究所发明的中枢抗胆碱能国家 一类新药，拥有中国专利两项和英美专利各一项。盐酸苯环壬酯片上市十多年来， 用于晕动病的防治，具有疗效强，中枢不良反应小的优点。进一步的动物研究及 临床报告表明，该药对椎动脉供血不足引起的眩晕、位置性眩晕、帕金森氏综合 症和癫痫等，同样具有较好的疗效U4。目前已证实分离得到的两种光学异构体 中，左旋盐酸苯环壬酯是活性异构体，其在一定程度上比消旋体的药效更强，毒 副作用更小，具有更好的临床应用前景4。考虑到口服片剂起效慢，生物利用度 较低，本研究结合左旋盐酸苯环壬酯临床适应症的要求和鼻喷剂的特点，制备了
9、 左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂，以提高其吸收速度，增强药效，同时方便病人用药。本文对已制备的左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂进行安全性评价，并比较鼻喷剂和 片剂的体内药动学过程，计算鼻喷剂的相对生物利用度，为临床合理用药提供实 验数据。1. 实验材料1.1仪器光学显微镜（Olympus，日本产）；倒置光学显微镜（OLympus BH40）； TSQQuantum型液相色谱一质谱联用仪（LC/MS/MS）；台式高速离心机（Hermle，Z200A，德国产）；F-33 pH/mV/C计（北京屹源电子仪器科技公司）；色谱柱:C8柱（2.0mmx100mm，5pm，日本资生堂公司）等。1.2药品与试剂1.2.1制剂受
10、试制剂（T）：左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂（1mg/100pL/喷，批号080104, 自制）；标准参比制剂（R）：左旋盐酸苯环壬酯片剂（1mg/片，批号070430，军 事医学科学院毒物药物研究所六室制）；左旋盐酸苯环壬酯水溶液（10mgmL-1， 自制）。1.2.2药品与试剂左旋盐酸苯环壬酯标准品：批号030505，纯度99.8%，军事医学科学院六 所药化室纯化；2H3-盐酸苯环壬酯（内标）：纯度99.9%，军事医学科学院六 所药化室纯化；甲醇：色谱纯（SIGMA公司）；乙腈：色谱纯（SIGMA公司）；0.9% 生理盐水（北京双鹤药业）；去氧胆酸钠（北京化学试剂公司）；其它试剂均为分 析纯。
11、1.3受试动物Wistar大鼠（28只，雌雄各半，体重200300g，由军事医学科学院动物中 心提供）；中华大蟾蜍（9只，体重3050g，雌雄不限，由首都医科大学实验动 物部提供）；比格犬（6条，雌雄各半，812kg，由科宇实验动物中心提供）。2. 实验方法2.1局部刺激性研究2.1.1供试品制备左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂作为供试制剂，另配制10mgmL-1原料药 左旋盐酸苯环壬酯水溶液作为参比制剂。以1%去氧胆酸钠水溶液为阳性对照， 生理盐水为阴性对照。2.1.2实验设计表1左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂局部刺激性实验设计方案组别动物数 给药量动物处置时间生理盐水组450pL/每侧鼻孔一个周期末4只
12、1%去氧胆酸组850pL/每侧鼻孔一个周期末4只，恢复期结束4只左旋盐酸苯环壬酯鼻喷组左旋盐酸苯环壬酯溶液组850pL/每侧鼻孔一个周期末4只，恢复期结束4只850pL/每侧鼻孔一个周期末4只，恢复期结束4只2.1.3给药和取样方法各实验样品通过微量进样器滴入大鼠鼻腔内，两侧鼻孔各50pL,分别停留 20秒，以防外漏流失，每日一次给药，连续给药5天。于末次给药后24h心脏 灌流处死大鼠，取大鼠鼻中隔及其上黏膜。恢复期组停药后饲养一周处死，取 鼻中隔及其上黏膜。2.1.4标本的处理和制备将所取组织放入10%福尔马林溶液中浸泡固定，石蜡包埋切片，HE染色， 10x20倍光学显微镜下进行观察。2.1
13、.5鼻黏膜局部刺激性的评判标准轻度：黏膜上皮细胞完整，黏膜下少量炎细胞浸润，杯细胞密度增加；中度：黏膜上皮细胞水肿，黏膜下炎细胞浸润；重度：黏膜上皮细胞变性坏死，大量炎细胞浸润。2.2纤毛毒性研究2.2.1供试品选用文献公认有严重纤毛毒性的去氧胆酸钠（1%水溶液）作为阳性对照，生理盐水为阴性对照，考察使用剂量的左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的纤毛毒性。2.2.2在体法考察鼻喷剂的纤毛毒性蟾蜍仰卧固定，使口腔张开，于上腭粘膜处滴加试验样品0.5mL（n=3），使 浸没上腭，接触0.5h，将蟾蜍断头后，迅速用锋利的眼科手术剪取一块儿约 3x3me的上腭粘膜，生理盐水洗净血块及杂物，粘膜纤毛面向上平铺于载玻
14、片 上，轻轻盖上盖玻片，于15x10倍光学显微镜下观察纤毛运动情况，随后置于加 有少量蒸馏水的层析缸中，密闭，使水蒸气近饱和状态，环境温度20-25 C。此 后每隔适当时间取出观察，如纤毛持续运动则放回层析缸中，记录从给药开始全 纤毛运动停止所持续的时间。用生理盐水小心洗净粘膜上的药液，继续观察纤毛 运动是否恢复，记录恢复试品的持续运动时间。2.3药代动力学和生物利用度研究2.3.1液相色谱-质谱联用法（LC/MS/MS）测定犬血浆中的左旋盐酸苯环壬酯2.3.1.1色谱条件液相参数：色谱柱：C8柱（2.0mmx100mm，5pm）；流动相：乙月青：水：甲酸=60： 40： 0.1，流速0.2m
15、Lmin-1，进样量20pL；柱温为室温。质谱参数：LC接口采用气动辅助电喷雾离子化电离源（ESI），喷雾电压4.8KV；加热 毛细管温度（TEM） 300C；鞘气N2，流速10psi；辅助气N2，流速1psi；碰撞 气（CID） Ar，压力1.5 （mTorr）；源内碰撞诱导解离（Source CID）能量为10V， 左旋盐酸苯环壬酯和内标2H3-盐酸苯环壬酯的碰撞能量均为43ev；正离子方式 检测；质谱扫描方式为选择反应监测（SRM）；分别测定左旋盐酸苯环壬酯和内 标2H3-盐酸苯环壬酯的正离子m/z358.2156.1和m/z 361.2159.1；扫描时间 0.5s。2.3.1.2血浆
16、样品的处理方法取血浆100J1L，依次加入100J1L甲醇、90pL 2H3-盐酸苯环壬酯（内标， 20ng-mL-1）、400pL乙腈，涡旋震荡，充分沉淀蛋白，14000rpm离心6min，上清液进样。2.3.2药代动力学和生物利用度2.3.2.1实验设计本试验采用双处理、两周期交叉试验设计，受试动物为健康比格犬6只，体 重812公斤。比格犬随机编号分成两组，每组三条比格犬，在每个研究期中分 别交叉给予左旋盐酸苯环壬酯的一种制剂。给药计划如表2所示，表中T代表 受试制剂，R代表参比制剂，两周期间洗净期为1周。表2生物利用度研究交叉给药方案表受试动物周期I周期II1RT2RT3TR4TR5RT
17、6TR2.3.2.2给药剂量参比制剂：左旋盐酸苯环壬酯片剂，lmg/片，2片/犬；受试制剂：左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂，1mg/100pL/喷，2喷/犬，左右鼻 孔各喷一次。2.3.2.3给药与血样采集将受试动物随机分成2组，每组3只。给药前禁食12h，实验时，一组给予 左旋盐酸苯环壬酯片剂mg/片，2片/犬，（用手将犬嘴掰开，用长镊子夹住药片 放到喉咙口，用10mL水冲服，并立即将比格犬嘴闭合维持半分钟，使其咽下）。 另一组鼻腔给予左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂1mg/100pL/喷，2喷/犬，左右鼻孔 各喷一次。喷药时，将比格犬头部固定，使鼻腔保持水平，将鼻腔喷雾器插入鼻 内约10mm，将药液
18、定量喷入鼻腔中，给药后将比格犬头部保持水平姿势1分钟以上，以免药液流出。每种剂型给药后都要有适宜的间隔时间，以保证有足够的 采血时间，给药后2h可给水喝，给药后3h可喂食。比格犬片剂给药后 10、15、30、45、60、90、120、240、360、480、720min 和鼻喷给药后 2、5、10、20、30、45、60、90、120、240、360、480、720min 分别于前或后腿静脉取血1.52mL置含肝素的离心管中，倒置数次，使肝素充分 溶于血浆，1h内离心，4000rpmx15min，分离血浆后标注试验号。血样放置-20C 冰箱中冻存待处理分析。一周后交叉给药，同上取血处理，血浆冷
19、冻储藏备用。3. 实验结果3.1左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的局部刺激性各组光镜观察结果见图1：A生理盐水组光镜观察结果B去氧胆酸未恢复组光镜观察结果C原料药未恢复组光镜观察结果D鼻腔喷雾剂未恢复组光镜观察结果E原料药恢复组光镜观察结果F鼻腔喷雾剂恢复组光镜观察结果图1局部刺激性考察各组光镜观察结果生理盐水组：镜下可见鼻甲软骨两侧黏膜表面被覆正常的假复层柱状纤毛上 皮，细胞排列紧密，其上可见纤毛，细胞间质中分布着小血管和腺体。去氧胆酸钠未恢复组：镜下可见鼻甲软骨侧面黏膜被覆的假复层柱状纤毛上 皮细胞变性坏死，其上纤毛完全脱落，大量炎性细胞浸润，细胞间质充血。原料药未恢复组：镜下可见鼻甲软骨侧面黏膜被
20、覆的假复层上皮杯状细胞消 失，伴明显上皮鳞化，细胞间质中血管扩张充血，部分炎性细胞浸润。鼻腔喷雾剂未恢复组：镜下可见鼻甲软骨两侧黏膜表面被覆正常的假复层柱 状纤毛上皮，杯状细胞和纤毛较完整，但细胞间质中可见部分血管扩张充血。去氧胆酸钠恢复组：镜下可见鼻甲软骨侧面黏膜被覆的假复层柱状纤毛上皮 恢复不明显，上皮下仍有大量炎性细胞浸润和细胞间质充血。原料药恢复组：镜下可见鼻甲软骨侧面黏膜被覆的假复层上皮有所恢复，可 见杯状细胞和纤毛，但仍有部分炎性细胞浸润。鼻腔喷雾剂恢复组：恢复至接近生理盐水组情况。由结果可知，左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂对大鼠鼻腔黏膜有轻度刺激性和毒性，给药后黏膜下少量炎性细胞浸润
21、，但损伤可逆。3.2左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的纤毛毒性结果见表3。阴性对照生理盐水组的纤毛摆动时间(LTCM，the lasting time of ciliary movement)为(21010.0)min(n=3)，给予去氧胆酸钠后，LTCM 为 0min(n=4) 观察不到纤毛摆动，黏膜表面杂乱，纤毛完全脱落，说明对黏膜组织及纤毛运动 有严重影响。表3左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的纤毛毒性(n=3)供试液LTCM(min)左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂642.31%去氧胆酸钠(阳性对照)0生理盐水(阴性对照)21010.0关于纤毛毒性的程度，目前尚无定论。一般认为，液滴和微粒在鼻黏膜上的 停留时间
22、不超过30min5，由于该制剂不属于长期用药，因此，认为左旋盐酸苯 环壬酯鼻腔喷雾剂对纤毛的毒性在可接受程度之内，当然，还需要用病理学检查 进一步验证。3.3左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的药代动力学过程和生物利用度3.3.1血药浓度-时间数据不同给药途径的血药浓度-时间数据如表4和5所示。表4比格犬单剂量给予左旋盐酸苯环壬酯片剂Qmg/犬)后不同时间血药浓度时间(min)血药浓度(ng/mL)123456MeanSD10.00.530.160.690.400.400.400.430.1715.01.400.230.320.941.140.600.770.4730.02.310.260.684.074
23、.190.752.041.7645.03.200.400.852.732.494.272.321.4660.03.940.540.524.031.894.482.571.8190.05.791.280.504.621.081.892.532.15120.02.611.782.683.591.301.442.230.88240.01.011.342.421.331.240.941.380.54360.00.710.750.591.271.080.690.850.27480.00.500.650.220.580.840.550.560.20720.00.120.200.090.240.470.29
24、0.230.14表5比格犬单剂量给予左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂（2mg/犬）后不同时间血药浓度时间（min）血药浓度（ng/mL）123456MeanSD2.07.691.488.031.802.120.653.63 3.325.08.718.5213.082.335.823.597.01 3.9310.012.7210.5017.764.319.275.5910.03 4.9020.011.6611.4612.535.968.507.559.61 2.6430.09.9512.0612.035.936.164.478.43 3.3360.06.455.037.595.134.423.695.39
25、 1.4190.06.073.366.484.922.892.424.36 1.71120.05.132.666.234.842.781.863.92 1.72240.02.881.532.674.632.671.492.65 1.15360.01.731.322.362.010.881.131.57 0.56480.01.021.071.601.700.850.621.14 0.42720.00.772.000.960.820.250.290.85 0.643.3.2血药浓度-时间曲线根据表4和5的数据，作出两种不同给药途径的血药浓度-时间曲线，如图2 所示。的平均血药浓度一时间曲线(n=6
26、)3.3.3药代动力学参数将实测的血药浓度数据用3P97药代动力学程序进行拟合，根据AIC最小 原则和F检验结果判定药物动力学模型，并进行拟合，计算主要药动学参数。结果显示：左旋盐酸苯环壬酯片剂及鼻腔喷雾剂的体内过程均符合二室模 型。其药代动力学参数分别列于表6和7中，对鼻腔喷雾剂和片剂主要动力学参 数的比较见表8。表6比格犬单次给予左旋盐酸苯环壬酯片剂的药代动力学参数(n=6)犬号tmax(min)maxa(ng* mL-1) (min* mL -1)t1/2ke(min)AUC0-t(ng* min* mL -1 ) (ng*AUC0-i min* mL -1)160.672.890.02
27、171.03869.61897.112158.221.440.01138.29589.63642.223142.131.040.01412.68669.11681.73464.663.680.02192.751057.911118.86525.592.300.06507.52772.13975.63692.721.530.02319.10680.13801.95Mean90.672.150.02290.23773.09852.92SD51.041.000.02148.22169.44181.13表7比格犬单次给予左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的药代动力学参数(n=6)犬号tmax(min)Cmax(n
28、g* mL -1)(ka:min* mL -1)t1/2ke(min)AUC0-t(ng*min* mL -1)AUC0-I(ng*min* mL -1)114.4711.830.21275.572053.852336.75212.6112.470.18441.181547.052002.8638.6214.900.41312.542466.952898.08432.955.760.12248.812089.062331.76512.238.720.16174.821344.271399.15613.786.290.15214.801006.971088.45Mean15.7810.000.2
29、0277.951751.362009.51SD8.653.660.1093.08543.91666.55表8比格犬单次给予左旋盐酸苯环壬酯片剂和鼻喷剂的药代动力学参数比较(n=6)剂型药动学参数 P值鼻喷片剂tmax (min)15.78+8.6590.67+51.040.015*Cmax(ngml4)10.00+3.662.15+1.000.001*t1/2ke(min)277.95+93.08290.23+148.220.887ka(min*mH)0.20+0.100.02+0.020.011*AUC0t (ng*min*mH)1751.36+543.91773.09+169.440.00
30、4*AUC01 (ng*min*mH)2009.51+666.55852.92+181.130.004*对以上药代动力学参数进行统计学评价，经方差分析，t 、k、t“,k、c 、 max a 1/2ke maxAUC0-t、AUC0-I在参比制剂和受试制剂之间有显著性差异(P0.05)。鼻喷剂tmax明显小于片剂，达峰 时间约比片剂快5倍；鼻喷剂峰浓度明显高于片剂，约为片剂的2.5倍；鼻喷剂 的吸收速率常数ka比片剂快2.6倍。3.3.4相对生物利用度的计算将左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂的血药浓度-时间曲线下面积(AUCJ与片剂 UT的血药浓度-时间曲线下面积相比较，根据下面公式，计算出每条比格
31、犬的相对生 物利用度(F)。AUC、/Dose,.、X100%F= 0-t (in) (in)AUC0-t (os%。)式中：in代表鼻腔给药；po代表口服片剂。由于我们给予的参比制剂和受试制剂的剂量相同，所以上式可简化为：F= AUC0-t (in) X100%AUC0-t (po)各动物参比制剂和受试制剂的生物利用度见表9。表9比格犬单次给予左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂和片剂的相对生物利用度(n=6)犬号AUC0-t相对F(%)x SD(%)鼻喷剂片剂12053.85869.612.3621547.05589.632.6232466.95669.113.692317942089.061057.9
32、11.9751344.27772.131.7461006.97680.131.48由表9可知，左旋盐酸苯环壬酯鼻腔喷雾剂对片剂的相对生物利用度为 (23179)%。4. 讨论4.1在左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂的安全性评价方面，我们采用了常用动物大鼠 和蟾蜍来考察制剂的鼻黏膜刺激性和纤毛毒性。关于给药量、给药频率和周期， 文献报道差异较大，给药量10200pL皆不等，给药频率13次/天，给药周期 37天。一般认为安全性与药物浓度有关，与给药量关系不大7，因此本文选用 实际处方，给药量100pL，每天给药一次，连续给药5天。4.2外消旋体盐酸苯环壬酯的长期毒性显示，狗每天4.0mg-kg-i，连续给药
33、12 周，无任何毒性反应。根据人与动物用药剂量换算，人每天用量为0.40.8mgkg-1 或2448mg/成人是安全的。由此，我们推断，虽然左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂对 片剂的相对生物利用度为(23179)%，Cmax为片剂的5倍，但血药浓度仍在安全 范围之内，当然，这需要进一步的毒性学实验确证。4.3鼻腔给药作为一种局部给药、发挥药物全身治疗作用的给药方式具有广泛 的应用前景冏，但目前已上市的制剂并不多，有效性和安全性是限制其应用的主 要因素。本文研究中，左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂引起的纤毛抑制作用可逆，作为 非长期给药其纤毛毒性尚可接受。比格犬给予左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂后，T a max 在15m
34、in左右，且在2min时，平均血浓已经高于片剂的峰浓度2倍左右，对于 将要乘车和已经乘车的人，左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂能够迅速起效，达到防治的 效果，而且鼻腔给药简单易行，在缺水情况下和对有吞咽困难的人群尤其适用。4.4血药浓度数据显示左旋盐酸苯环壬酯鼻喷剂相对片剂大大提高了生物利用 度，由于该药能通过血脑屏障，同时鼻腔给药本身具有脑靶向的特性，因此这是 否提示该剂型提高了药物在脑组织中的分布，还需要进一步的实验验证。致谢：本文由张晓燕归纳、整理，对她付出的辛勤劳动深表谢意。参考文献：1军事医学科学院毒物药物研究所。盐酸苯环壬酯的新用途。中国， 02148933P。 20040602。 军事医学
35、科学院毒物药物研究所。盐酸苯环壬酯的新用途。中国， 01104890P。 20010912。3军事医学科学院毒物药物研究所。盐酸苯环壬酯的新用途。中国， 01104881P。 20010912。4军事医学科学院毒物药物研究所。苯环壬酯光学异构体及其用于制备药物的用途。中国，200410096165P。20050928。5 陆彬。药物新剂型与技术M。北京：人民卫生出版社，1998, 451463。6 Kanthakumar K., Cundell D.R., Johnson M., et al. Effect of salmeterolon human as alepithelial cell
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