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1、布鲁克液质联用仪操作规程1操作前检查1.1检查液氮罐和高纯氮的出口压力，保证在正常范围1.2检查洗针溶液和流动相1.3流动相须现配并超声，缓冲盐溶液过0.22以质孔滤膜（或者使用色谱纯的盐溶液和酸溶液）1.4如使用溶融石英进样管，操作前应检查石英管是否拉长，确保其未超出ESI探针尖端。1.5检查系统真空度，电离真空计读数（分析仪区域）应小于5X10-6 Torro1.6检查废液液位，及时清空废液。1.7检查液氮罐和氦气钢瓶是否有一定压力，以便为测试样品提供符合流速和压力要求的氮气（喷雾 气体和干燥气体）和氦气（碰撞气体）。2操作步骤及注意事项1 .检查并打开干燥气（Dry gas）和雾化气（N
2、ebulizer Gas）所需的氮气源；1）如配备液氮罐，则需打开增压阀及供气阀阀门，使罐体压力保持在100 psi以上，并调节减压阀 出气口压力至0.6 Mpa；2）如配备氮气发生器，则提前半小时打开氮气发生器电源，以便使氮气能够达到99.99%以上的纯度， 再调节氮气流量至20 L/min ；2 .检查并打开碰撞气（Collision Gas）高纯氮气N2或高纯氩气Ar钢瓶（纯度要求99.999%）,并调 节减压阀出气口压力至0.4 Mpa；3 .检查机械泵泵油的水平线，需在小窗口的1/2 2/3之间；4.打开计算机，显示器电源；5 .打开质谱仪主机电源（仪器左侧最下方）；6 .启动mic
3、rOTOFcontrol控制软件，务必保持仪器一直处在shutdown状态，待真空度达到芸1x 10e-6mbar后，才可切换至standby状态待机；为了保证良好稳定的实验结果，待真空度下降至 10e-7mbar以下后，再operate仪器开始测试。2.2新建液相方法打开hystar软件，选择method,然后输入新建方法的名字，点击open，开始方法的新建。在弹出的 对话框中选择edit，然后点击“wizard”进行设置。液相方法包括梯度、流速、柱温、样品盘温度、时 间、进样针吸样速度等，可依次设置即可，全部设置好之后，将。 hystar2.3新建质谱方法方法一：在otofcontrol中
4、,打开method,按照自己待检测物的分子量范围及正负偏向性选择合适的质谱方法，小分子有对应的small molecular方法，蛋白质组有专门的proteomics方法。方法二（非专业人员不推荐）：在otofcontrol中，打开method，选择new，即可新建质谱方法。可以修改的参数包括以下几个方面：（1）mode 中的 Focus 为 active，line spectra calculation 为 use sum intensity，ion polarity 为 pos 或 neg，mass range调到待检测物合适的分子量范围。（2）source 中 capillarypos
5、: 4500V, neg : 3500。Divert valve : source1-2 进质谱；source1-6 为 discard to fluid（3）Tune中collision RF小分子调到1000-1500,大分子调到2000-2500 ； low mass视目标物分子量 大小截留（例如目标分子为500，可调为300，去掉小分子区域的杂峰）。（4）MS/MS中如果想检测二级，可以勾选auto MS/MS ； precursor ions中cycle time正常下为3s（5）chromatogram 中选择 BPC根据待检测物的分子量大小和正负偏向性，先在软件自带的质谱方法中选
6、择相应的方法，再在此方 法的基础上进行优化及分段（如含盐的样品截掉前2-5分钟，1-6 waste）。仪器在操作状态下稳定20-30分钟后即可开始仪器质量准确度校正。2.4仪器质量准确度校正2.2.1. 药物和酶解多肽样品，选用甲酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z90-1200 ；校正模 式选用 Enhanced Quadratic。2.2.2. 蛋白质类样品选用三氟乙酸钠溶液作为校正标准液。覆盖质量范围m/z 200-2000 ；校正模式选 用 ik DWdxr ghi 蛔，样品表以E戏哦形式列出，界面整洁；，支持Windows K用的胞虬粘帖等命令,方便修血样曲盘位骨数拥保存路程样
7、品表编辑界面MethodsMfi (mqOIOF dene可姓格所有方法会并保存生成Su per method,即第二步中可调用的方法；A康谱方法的国辄在mlcrOTOFcontrol中.编辑好后保存为质谱方法文件.hystar中 点能调用文忏，系统控制和状态区当前样品信息PjQ于Agilent被相，控制命令在相庞模块的右键渠单中i#对于Dioiwx被粗和Watars.可近入其自身的控制坟件界面波相控制冲操*请参海植福系就说明书：志区显示为曲!色时.衰示所有系统府缶毓墙，可开始果象敷据；点击start 始散据聚集Bniho-r DHuintH.-分槌块握示，被相系统泉、避持器、柱温箱，磴测器等
8、）.腐谱春统等:数据采集使用批量采槃可更灵活、莎便的漆加成鞘隙样品目ifU&ir Q-iitfuni：-采集结束后的系统设置Acquisilion - Define shutdown seltinisDfrfho shutdown &md*iarw! 0Altei% (Or Mb H 5smpta in eutgEpls 5qwxc)：Srop H HLC Piwpmin1 10.00IV 7 Swich 闵 UV Dewier lamp觥 自动关闭岭剽器Q Srtiltti ME to stands切换质滑到待fll拭森I idwI ia.aoOKCwcfelQinuker Daltcnkn
9、4. 输入下列参考参数4.1. 直接进样：(低流速)大约在120- 180微升/小时离子源：Nebulizer 0.4 barDry Gas 4.0 L/minDry Temp 180C。4.2. 药物小分子样品液质联用：平均流速大约在200-300 uL/min离子源：Nebulizer 0.8 barDry Gas 6-8 L/minDry Temp 180C。4.3. 酶解多肽样品液质联用：平均流速大约在200-300 nL/min离子源：Dry Gas 3.0 L/minDry Temp 160C5. 手动获得一个MS/MS图谱打开 MS/MS 界面，选择 MRM-输入Parent C
10、ondition列表，激活 ScanMode。6. 后期处理6.1打开分析文件6.1.1. 在任务栏中或者在工具栏中选择按钮均可切换到数据分析程序(DataAnalysis),读取所获得的 数据文件6.1.2. 读取数据文件被可选择File菜单下的open对话框，所需要的显示窗口将被程序自动打开。6.1.3. 在文件对话框中选择目录d:datastart用鼠标键双击test0000.d, test0001.d, test0002.d来打 开数据文件；按住shift键来标记所有文件并点击回车键来一次全部打开所选文件。6.1.4. 质谱图与色谱图按文件名读取并显示在File菜单下。在分析清单窗口下
11、选择所需的文件，选 择后图谱在各自的窗口下显示。6.2质谱图6.2.1. 在分析清单窗口下选择的结果在质谱图窗口显示。6.2.2. 通过Masslist参数对话框改变离子检测参数6.2.3. 下列对话框被用来在图谱中设置新的离子检测参数6.2.4. 对下一步的 Method 参数设置参见 Bruke Daltonics DataAnalysis Reference Manual6.3色谱数据6.3.1. 完整色谱图1. 读取数据文件(e.g. test0001.d)，显示 TIC ( Total Ion Chromatogram)2. 读取某一离子的色谱数据可以打开Edit Chromatog
12、ram Traces对话框3. 通过Edit菜单下选择Chromatogram选项来打开Traces对话框 如下图所示，选择质荷比为622的离子。6.3.2. 获得各组分的质谱图(Compound spectra)使用Find - Compound功能键，快速有效的产生各组分的质谱图；1 )功能键Compounds-Chromatogram产生色谱分离过程中所有组分的质 谱图。打开Compound Spectra窗口时，可以看到各组分的质谱图。2) 功能键Compounds-MS(n)产生所有采用MS(n)步骤采集的图谱。3) Compounds-AutoMS(n)产生 MS-和 MS/MS
13、图7. 报告有几种可用的报告形式来输出数据，一种报告仅有质谱图，另一种报告则只有色 谱图，还有一种两种图谱都保留。7.1. 直接打印：打印键；或者打开File菜单，选择Print ；或者通过打印 预览打印，选择打印预览键或在File菜单选择Print Preview，然后在打印预 览窗口下选择打印键7.1.1报告内容下拉菜单包含了所有可选的报告内容7.1.2. 获得参数报告选择此内容的报告中包含了获得所选分析结果的参数7.1.3. 显示报告选择此内容将完全按照显示窗口打印(包括色谱窗口、质谱显示窗口、混合 物质谱窗口、质谱窗口)7.2 质谱图报告内容中几种可选的质谱图形式7.2.1. 质谱清单
14、报告报告中含所选的质谱图的peak清单7.2.2. 质谱图报告报告中含所选的质谱图报告7.3色谱图报告内容中几种可选的色谱图形式7.3.1色谱清单报告报告中含所选的色谱图的色谱峰清单7.3.2色谱图报告报告中含所选质谱图的报告7.3.3混合质谱图报告报告中含所选色谱图的混合质谱报告Divert Valve废液模式（不含定量环）Divert valve in source position* greor)(HPLC) to yellow* blue (caiibfant) via loop to gray (waste)Divert in waate position：+ green (HPLC
15、j 店 cennficted to grey (waste) -a HPLC flow is not conneGled to source (ihi& 匡 uspCliI fo flushing HPLC ar ctjluinn. blue (calibrant) is connected to yellow (nebulizer).Conclusion:, no constant How, fiow rate is dependent on valve position(HPLC flow synnge flow), calibration can be done in micrOTOFc
16、ontrol software or in post processing software. valve can be ued for switching HPLC flow directly to wate., syringe pump can be used for infusions.fh 加富由硕 f wafC砖F Sr. Tiiw-fiir N r Anm jj w F? fFnsbfangi 1_届 ScIhhch TMk fiscwl an . SpBc+nMTwfarY方法编辑区-MS/MS页面：MRMMRM匝 AlioISCCdlimn匚澜Ui-e)#ct. Masilio
17、LWidhCofl. EnegyIGClDEiwgyAcq FactorA回92200law5Q0ID1.01回1做OQTOOg1 0? MRM （去反应监测）页面可定义手工一级质谱的相关参数, MRM是真正的二级质谱，由四级杆实现暨离子的选择;只有合适的碰撞能量才能获得理想的二级质谱图,不建议使用碰撞能量自动优化；Bmker DaltanicE液质联用小常识1. 通讯问题有时会在液质联用中出现，一般通过重启软件或电.脑解决;2. 自动进样未完成时，容易出现通讯问题，建议不要做任何动作；3. 建议打开hystar前关团单独运彳丁的micrOTOFcontrol；4. 液质联用流速不要大于0.4mUmin （分流或用细内径的柱Kid =2.1 mm）；5. 流动相中尽量避免缓冲盐和表面活性剂；6. 平衡柱子和冲洗柱子时，不要连质谱；7. 注意液相系统的日常维护，Data Analysis软件使用峰面积积分化合物搜索鉴定smartformula manuallyselect the molecular that you wantedfind the chemical formula that you wanted and right click then send it to compound crawler
