干扰载体构建SOP.docx

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1、shRNA干扰载体构建SOP目录第一部分第二部分第三部分第四部分第五部分第六部分RNA干扰原理及shRNA设计2酶切与回收6退火与连接7转化与涂平板9挑菌与菌液PCR 11质粒提取13第一部分RNA干扰原理及shRNA设计标准操作规程(SOP)1.目的：理解RNA干扰原理，设计shRNA干扰序列2-仪器与设备：需要可以连接Internet的个人计算机，引物设计相关软件(如Primer Premier 5)。3. 操作步骤3.1 RNA干扰原理1) RNAi概述：RNA干扰RNA interference, RNAi是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNAdouble-stranded RNA

2、，dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。简单 的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性 mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异 性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。由于RNAi具有高度的序列专一 性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量 的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到 包括功能学，药物靶点挑选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。2) RNAi原理：RNA干扰

3、包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶 段，小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据说明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员， 它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引 入的双链RNA，形成19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物RNA-induce

4、d silencing complex, RISC。激活 RISC 需要一个 ATP依赖的将小分子 RNA 解 双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录体上，并在间隔siRNA 3 端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割确实切机制尚不明了，但每个RISC都包含一 个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。3) RNAi示意图(见图1)3.2 shRNA 设计1) shRNA:即short hairpin RNA(短发卡RNA)，包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹构造MhRNA在体内可以被加工成siRNA 从而降解目的

5、基因.。示意图见图2。2) shRNA作用原理：见图3。3) shRNA设计原那么： 克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop) 序列分隔的，组成发夹构造，由poim启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA 聚合酶III的转录终止子； 两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点； StrataGENE发现29个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效的抑制目 的基因； 在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以 确保转录的发生； shRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。假如选择的目的序 列不

6、以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G； ShRNA插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环 都被成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有 shRNA插入片段的克隆。在比拟了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列 最为有效(AMBION use)； 5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)； 在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T，这可能导致shRNA转录的 提早终止； 从转录本(mRNA)的AUG起始密码开场，寻找“AA或者NA二连序列，并记下其 3端的19个碱基序列，作为潜

7、在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个 碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。图2 shRNA示意图图3 shRNA作用原理4) shRNA设计举例 以人源基因VEGFC为例，选取干扰靶点序列为：GCCGATGCATGTCTAAACT 在该序列两端加上酶切位点，中间插入Loop环，设计shRNA片段：BamH I 靶点序列环构造靶点反义序列HindIIIGATCC GCCGATGCATGTCTAAACT TTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTTAG CGGCTACGTACAGATTTGA AAGTTCTCT TCAAATCTGTACGTAGCCGAAAA

8、ATTCGA 正反向Oligo序列分别为：H-VEGFC-sh-F:5-GATCC3CCGATGCATGTCTAAACTTTCAAGAGAAGTTTAGACATGCATCGGCTTTTTT-3H-VEGFC-sh-R:5-AGCTTAAAAAAGCCGATGCATGTCTAAACTTCTCTTGAAAGTTTAGACATGCATCGGE3将该Oligo片段正反向一起混合退火后，即可直接与载体进展连接，构建shRNA干扰载 体。第二部分干扰载体概述 标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S2：干扰载体概述起草人/修订人何章荣修订日期2021 .7审核人审核日期批准人批准日期

9、颁发部门1. 目的：理解干扰载体的特点2. 载体概述 带有U6启动子，保证shRNA的高表达； 带有GFP标签，可用于检测转染效率； 带有多克隆位点； 带有新霉素(Neomycin)抗性，可用于挑选稳定细胞株3. 载体图谱Polylinker:78-101U6 Promoter: 6131-77 CMV Promot&r: 140-727 cGFP745-1463SV40 Promoter: 2152-2497Neomycin:253S-3332pUC orii： 404&-4536Ampicillin:4834-5694Forward Sequencing Primer: WDM DRNAr

10、LI&FwmE (TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG)Reverse Sequencing Primer DA0012; dRNAR缸割郭 (TAGAAGGCACAGTCGAGG)图载体图谱第三部分酶切与回收 标准操作规程（SOP）实验名称shRNA干扰载体构建SOP S3：酶切与回收起草人/修订人何章荣修订日期2021 .7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的：通过酶切可以获得带酶切位点的线性化质粒载体，使用试剂盒对其进展回收。2. 试剂与材料名称公司货号限制性内切酶Thermo1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenCycle Pure

11、 KitOMEGAD6492-013.仪器与设备名称公司货号MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-804. 操作步骤4.1酶切以Thermo内切酶为例，准备好冰盒，将所需试剂从冰箱中取出后置于冰上，待试剂融化后， 在离心管中参加：10xbuffer Tango5rL内切酶 Hindlll1rL内切酶BamHI1rLshRNA干扰质粒pNAT-U6.1 1曲ddH2Oup to 50rL盖紧管盖，离心15s。将离心管置于离心管架上，放入37水浴锅中，酶切1h（时间长短根 据酶的反响效率

12、而异，可参考产品说明书）。也可以直接使用PCR仪进展酶切反响。Notes: 根据酶的特点，可能要求用到BSA，可根据说明书进展操作。双酶切时，假如仅其中一 种酶需要用到BSA，那么也需要在酶切体系中参加BSA，因为BSA不会影响内切酶的活 性。 假设两个位点的内切酶使用一样缓冲液（即在该种缓冲液里酶活性最高），可参加两种酶 同时进展反响 假设使用不同缓冲液，那么可先进展单酶切，回收后再进展第二次酶切，再次回收。 由于载体上的两个酶切位点一般相距较近，有些酶需要更多的保护碱基，那么同时进展 双酶切可能效率不高。可先参加需要更多保护碱基（或是酶切效率较低）的内切酶，反响 完毕后回收（假如两种酶使用

13、同一类缓冲液，那么可省去回收步骤），再参加第二种酶进 展反响。酶切后的载体通过凝胶电泳别离然后回收纯化，去除切割下来的小片段，从而 降低假阳性。4.2酶切产物回收以OMEGA Cycle Pure Kit试剂盒为例。1）将酶切产物转移至1.5mL离心管，参加4-5倍酶切产物体积的Buffer CP；假如PCR片段 长度小于200bp，那么参加6倍体积的Buffer CP；2）漩涡震荡混匀，短暂离心，搜集管壁上的液体；3）将混合物参加至试剂盒提供的HiBind DNA吸附柱，10000g，室温离心1min；4）弃残液，参加 700rL DNA WASH Buffer，10000g，室温离心 1m

14、in；5）重复步骤4；6）弃残液后，13000，室温离心2min；7）将HiBind DNA吸附柱置于干净的1.5mL离心管，参加15-30RL Elution Buffer或ddH2O， 室温放置1-2min，13000，室温离心2min，搜集DNA产物。第四部分退火与连接 标准操作规程（SOP）实验名称shRNA干扰载体构建SOP、4：退火与连接起草人/修订人何章荣修订日期2021 .7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的：将单链的shRNA上下游片段进展退火，形成双链DNA片段，随后连接至酶切后的载体。2. 试剂与材料：名称公司货号5乂退火缓冲液自制shRNA Oligo 片段

15、华大基因ddH2O自制0.2mL PCR TubeAxygenp质粒载体金斯瑞T4 ligase康为生物CW08053.仪器与设备名称公司货号离心机ThermoPICO 17掌上离心机其林贝尔LX-200MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient移液器大龙4.操作步骤4.1退火1）按下表配制5 乂退火缓冲液:成分终浓度Tris50mM (pH 8.0)NaCl250mMEDTA5mM2）将合成好的Oligo片段用蒸馏水溶解稀释至100RM，在离心管中按下表参加各成分:Oligo F (100rM)4rLOligo R (100rM)4rL5乂退火

16、缓冲液2rL3） 一共10RL，短暂离心后将液体搜集至管底，放入PCR仪中，执行以下程序:95 C5min80 C4min75 C4min70 C4min65 C2min60 C2min55C2min50C2min45C2min40C2min37C2min20C20min程序完毕后，可4C短时间保存，或-20C长期保存。4.3 连接由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进展连接。退火后的混合物稀释10倍，使用1 10 RL移液枪在离心管中参加：10xbuffer1rLT4 DNA ligase0.1rL退火混合物（已稀释10倍）1RL酶切后载体3rLH2Oup to

17、10rL一共10rL，细微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s，PCR仪上22C反响30min。第五部分转化与涂平板 标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S5:转化与涂平板起草人/修订人何章荣修订日期2021 .7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的：将连接好的质粒转化大肠杆菌，然后涂平板进展挑选。2. 试剂与材料名称公司货号DH5a博迈德琼脂糖Biowest琼脂粉BIOSHARP氨苄青霉素Axygen胰化蛋白胨OXOIDL42酵母提取物OXOIDLP0021NaCl湖南汇虹一次性使用培养皿姜堰市为尔康医用品公司1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR t

18、ubeAxygen3.仪器与设备名称公司货号恒温摇床上海浦东物理化学仪 器厂THZ-92C移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-80净化工作台苏州净化SW-CJ-2D磁力加热搅拌器湘仪78-14.操作步骤4.1配制LB培养基 液体LB培养基：在大烧杯中参加900 ml去离子水，称取以下试剂参加烧杯中：胰化蛋白胨 10g酵母提取物 5gNaCl10g用搅拌器搅拌混匀，直至全部溶解。用去离子水定容至1L，121C高温蒸汽灭菌20min。 固体LB培养基：配置好液态LB培养基后，参加琼脂粉至终浓度1.5%，121C高温蒸汽灭菌20min。4.2转化插入片段和载体连接后，可直接进

19、展转化。1）翻开水浴锅，调至42C。准备好冰盒，将装有大肠杆菌感受态细胞DH5a（100RL）的离心管从-80C冰箱中取出，迅速置于冰上；2）待感受态细胞完全融化后，用1 10 RL移液枪将10RL连接产物参加离心管中，细微混 匀（动作需轻柔），置于冰上30min；3）将离心管置于42C水浴锅，热激90s，然后迅速取出，置于冰上5min；4）超净台中操作，在离心管中参加890RL不含抗生素的LB培养基，置于37C摇床上，200rpm震荡培养45min；5）超净台中操作，取100RL转化液涂布于含抗生素（如氨卞）的LB平板培养基，置于37C孵 箱，过夜培养。设置对照： 对照A-将双酶切后的载体质

20、粒直接进展连接反响（不加插入片段），然后进展转化。这 个对照可检测双酶切是否完全。假如长出克隆，说明双酶切不完全，部分质粒完全没有 酶切或只进展了单酶切，如没长出克隆，那么证明双酶切完全。 对照B.载体双酶切后，不进展连接反响，直接进展转化。假如长出克隆，说明有残留的未被任何酶切的原始质粒。 对照C：将未酶切的原始质粒直接进展转化，验证转化过程的正确性。假如长出大量克 隆，说明转化成功，否那么视为转化失败。 对照D：取20UL感受态细胞直接涂布于不含有抗生素的LB平板上，检测感受态细胞 的活性。假如长出大量克隆，说明感受态细胞活性好。4.3涂平板1）倒平板：将装有固体LB培养基的三角瓶（去掉封

21、口膜）放入微波炉，加热使培养基融化，取出后冷却至55C左右（手可触摸），在超净台内操作，参加抗生素（如氨苄青霉素，终浓 度100曲/mL），并充分摇匀。将培养基分装倒入一次性细菌培养皿，每个约10mL，室温 冷却凝固。可将培养皿用parafilm封口后，倒置放入4C冰箱保存备用。2）用移液器汲取100RL菌液滴至固体培养基外表，用弯曲的玻璃棒（事先酒精灯灼烧后冷却） 将菌液涂布均匀，待菌液吸收枯燥后，将培养皿置于37C恒温箱，倒置培养（倒有培养 基的一面在上）。Notes:以上需在超净工作台中操作，实验完毕后及时清理工作台面。倒平板时，一定要在 培养基冷却后再参加抗生素，以免温度过高导致抗生素

22、失效。第六部分挑菌与菌液PCR 标准操作规程（SOP）实验名称shRNA干扰载体构建SOP S6:挑菌与菌液PCR起草人/修订人何章荣修订日期2021 .7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的挑取菌落克隆培养，用菌液直接进展PCR，鉴定目的片段是否已插入载体。2. 试剂与材料名称公司货号琼脂糖Biowest琼脂粉BIOSHARP氨苄青霉素Axygen胰化蛋白胨OXOIDL42酵母提取物OXOIDLP0021NaCl湖南汇虹一次性使用培养皿姜堰市为尔康医用品公 司1.5mL tubeAxygen0.2mL PCR tubeAxygenHS Mix东盛生物P2082DNA marker东

23、盛生物3.仪器与设备名称公司货号恒温摇床上海浦东物理化学仪 器厂THZ-92C移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-80净化工作台苏州净化SW-CJ-2D磁力加热搅拌器湘仪78-1MAXYGENE Thermal CyclerAxygenMaxyGeneGradient4.操作步骤1. 挑菌1）待平板的菌落长至足够大到达可挑的程度（肉眼可见，直径约以上）；2）准备好假设干个离心管，各参加500uL含抗生素的LB培养基；3）用镊子夹取灭菌的牙签（或10RL枪头）挑取平板上的单菌落，在离心管内的培养基中蘸洗 几下，盖紧管盖后再将牙签丢弃于台外的搜集箱中（假设用10RL枪头，可

24、将枪头留在离 心管内）；4）接种过菌落的离心管在37C摇床中振荡培养，摇速250rpm；注意试管要在摇床上放好，有适当的倾斜角度45左右Notes:以上需在超净工作台中操作，实验完毕后及时清理工作台面。2. 菌液PCR1）挑取菌落在37C摇床培养4-5h至培养基呈浑浊状后，将离心管取出，取1RL；2） 在离心管中参加：HS PCR mix10rLForward primer(10uM)1rlReverse primer(10uM)W菌液WddH2O7rL3）一共10uL，细微吹吸混匀，盖紧管盖，离心15s。翻开PCR仪，将离心管置于PCR仪 上，盖紧保护盖，PCR程序设置如下：95C10min

25、95 C 30s355cCcles30s （退火温度根据引物Tm值不同而定）72 C30s （延伸时间随目的产物长度及酶的合成效率不同而定）72 C 7min4）PCR程序完毕后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，有目的条带的克隆即可送公司进展测 序鉴定。测序正确那么说明载体构建成功，可将该克隆扩大培养，提取质粒，以待后续 试验使用。第七部分质粒提取 标准操作规程(SOP)实验名称shRNA干扰载体构建SOP S7:质粒提取起草人/修订人何章荣修订日期2021 .7审核人审核日期批准人批准日期颁发部门1. 目的从菌液中提取质粒，以供下游实验(酶切，转染等)使用。2. 试剂与材料名称公司货号高纯度质

26、粒小提中量试剂盒天根生物DP107无内毒素质粒大提试剂盒天根生物DP117异丙醇湖南汇虹无水乙醇湖南汇虹50ml离心管琼脂粉BIOSHARP氨苄青霉素Amresco0339胰化蛋白胨OXOIDL42酵母提取物OXOIDLP0021NaCl湖南汇虹3.仪器与设备名称公司货号恒温摇床上海浦东物理化学仪器 厂THZ-92C移液器大龙掌上离心机其林贝尔LX-200恒温水浴锅精宏DK-80净化工作台苏州净化SW-CJ-2D磁力加热搅拌器湘仪78-1离心机ThermoPICO 17高速冷冻离心机湘仪H2050R4.操作步骤4.1质粒小提以天根公司试剂盒“高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)为例：1)柱平

27、衡步骤：向吸附柱CP4中吸附柱放入搜集管中参加500 rL的平衡液BL, 12,000rpm (13,400xg )离心1 min，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱重新放回搜集管中。请 使用当天处理过的柱子2) 取5-15 ml过夜培养的菌液参加离心管中，12,000 rpm (13,400xg )离心1 min，尽量吸 除上清。注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀搜集到一个离心管电菌体量以可以充分裂 解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。3) 向留有菌体沉淀的离心管中参加500 rL溶液P1 请先检查是否已参加RNase A，使用 移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：

28、请务必彻底悬浮细菌沉淀，假如有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯 度偏低。4) 向离心管中参加500 rL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所 用时间不应超过5 min，以免质粒受到破坏。假如未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不 彻底，应减少菌体量。5) 向离心管中参加700 rL溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白 色絮状沉淀。12,000 rpm (13,400xg )离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3参加后应立即混合，防止产生部分沉淀。假如上清

29、中还有微小白色沉淀，可再次 离心后取上清。6) 将上一步搜集的上清液分次参加过滤柱CS过滤柱放入搜集管中，12,000 rpm(13,400xg )离心2 min，小心地将离心后搜集管中得到的溶液分次参加吸附柱CP4中吸 附柱放入搜集管中，假如过滤柱中有剩余的液体说明步骤5汲取的上清中杂质过多， 可以延长离心的时间；假如离心后搜集管底部有少量的沉淀，尽量地汲取上清。7) 12,000 rpm (13,400xg )离心1 min，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱CP4放入搜集管中。 向吸附柱CP4中参加500 rL去蛋白液PD，12,000 rpm (13,400xg )离心1 min，倒掉搜集

30、管中的废液，将吸附柱CP4放入搜集管中。8) 向吸附柱CP4中参加600 rL漂洗液PW请先检查是否已参加无水乙醇，12,000 rpm (13,400xg )离心1 min，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱。?4放入搜集管中。注意：参 加漂洗液PW后，假如室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。9) 重复操作步骤9。10) 将吸附柱CP4重新放回搜集管中置于12,000 rpm (13,400xg )离心2 min，目的是将吸附 柱中剩余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反响酶切、PCR等实验。为确保下游实验不 受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟

31、，以彻底晾干吸附材料 中剩余的漂洗液。11) 将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 rL洗脱 缓冲液TB，室温放置2 min，12,000 rpm (13,400xg )离心1 min将质粒溶液搜集到离 心管中。注意:洗脱缓冲液体积不应少于100 rL，体积过小影响回收效率。且DNA产物应保存在-20C，以防DNA降解，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。假设用ddH2O做洗脱液，应保 证其pH值在范围内，pH值低于会降低洗脱效率。为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶 液重新参加离心吸附柱中，室温放置2 min，12,000 rpm (13,400x

32、g )离心2 min，将质粒溶 液搜集到离心管中。考前须知 溶液P1在使用前先参加RNaseA将试剂盒中提供的RNase A全部参加，混匀，置于 2-8 C保存。 使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37C水浴 中加热几分钟，即可恢复澄清。 注意不要直接接触溶液P2和P3，使用后应立即盖紧盖子。 所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进展离心，速度为12,000 rpm (13,400Xg )。 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。假如所提质粒为低拷贝质粒或 大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱 缓冲液

33、应在65-70C预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。 实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，进步得率。 用平衡液BL处理过的柱子最好当天使用，放置时间过长会影响效果。4.2质粒大提以天根公司产品“无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)为例：使用前请先在漂洗液PW中参加无水乙醇，参加体积请参照瓶上的标签。1) 柱平衡步骤：向吸附柱CP6中吸附柱放入50ml搜集管中参加2.5 ml的平衡液BL， 8,000 rpm (8,228 Xg)离心2 min，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱重新放回搜集管中。用平衡液处理过的柱子最好立即使用。2) 取100 ml 根据培养菌

34、体的浓度选择适宜的量，低拷贝推荐用200 ml过夜培养的菌 液参加离心管，室温8,000 rpm (8,228Xg)离心3 min搜集细菌，尽量吸除上清。注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀搜集到一个离心管电菌液量以可以充分裂 解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。尽量吸除上清，为确保上清 液全部汲取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。3) 向留有菌体沉淀的离心管中参加8 ml溶液P1请先检查是否已参加RNase A，使用移 液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，假如有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量 和纯度偏低。对于低拷贝质粒

35、，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P4的用量。4) 向离心管中参加8 ml溶液P2,立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5 min。注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，假 如未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5) 向离心管中参加8 ml溶液P4,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白 色分散絮状沉淀。然后室温放置10 min左右。8,000 rpm (8,228Xg)离心5-10 min，使 白色沉淀离至管底。注意：参加溶液P4后应立即混匀，防止产生部分沉淀。假如离心后倒入过滤器CS1中的溶 液有白色沉淀也不会

36、影响过滤。假如菌体过多100 ml，推荐延长离心时间至20-30 min。6) 将全部上清小心倒入过滤器CS1中请防止倒入大量沉淀而阻塞过滤器，渐渐推动推 柄过滤，滤液搜集在干净的50 ml的管中自备。7) 向滤液中参加倍滤液体积的异丙醇参加异丙醇过多容易导致RNA污染，上下颠倒混 匀后转移到吸附柱CP6中吸附柱放入50 ml搜集管中。注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请参加不同体积的异丙醇。吸附柱CP6的最大 容积为15 ml，所以需要分2次过柱。8) 室温8,000 rpm (8,228Xg)离心2 min，倒掉搜集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回 搜集管中。注意：将第7步中所得溶液

37、分2次过柱，每次均按以上条件操作。9）向吸附柱CP6中参加10 ml漂洗液PW请先检查是否已参加无水乙醇，8,000 rpm （8,228Xg）离心2 min，弃掉搜集管中的废液，将吸附柱重新放回搜集管中。10）重复操作步骤9。11）向吸附柱CP6中参加3 ml无水乙醇，室温8,000 rpm （8,228Xg）离心2 min,倒掉废液。12）将吸附柱CP6重新放回搜集管中，8,000 rpm （8,228Xg）离心5 min，目的是将吸附柱中 剩余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反响酶切、PCR等实验。为确保下游实验 不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP6开盖，置于室温

38、放置数分钟，以彻底晾干吸附材 料中剩余的漂洗液。13）将吸附柱CP6置于一个干净的50 ml搜集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2 ml 洗脱缓冲液TB，室温放置5 min，然后室温8,000 rpm （8,228乂甘）离心2 min。将50 ml 离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5 ml离心管，-20C保存。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新参加到吸附柱中，重复步骤13。洗 脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。假设用ddH2。做洗脱液应保证其pH值在范围内， pH值低于会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是根据质粒的拷贝数以及实验所需 要的浓度来确定。洗脱缓冲液体

39、积不少于1 ml，体积过小影响回收效率。DNA产物应保存 在-20C，以防DNA降解。可选步骤假如需要更高浓度的质粒，可进展如下操作：1）每1 ml洗脱液参加1.42 ml异丙醇以及0.42 ml 5M NaCl （客户自备），混匀，室温放置5 min， 8,000 rpm （8,228Xg）离心 10 min，小心弃上清。2）参加0.5 ml的70%乙醇洗涤沉淀，室温8,000 rpm （8,228Xg）离心5 min，小心弃乙醇。3）重复操作步骤2。4）空气中枯燥沉淀约5-10 min,根据需要用适当体积的TB缓冲液溶解沉淀。考前须知1）溶液P1在使用前先参加RNase A将试剂盒中提供的

40、RNase A全部参加，混匀，置于 2-8 C保存。2）使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象， 可在37C水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。3）注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。4）使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，防止滤膜因压力而松动。5）提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。假如所提质粒为低拷贝质粒或 大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓 冲液推荐在65-70C水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间，以进步提取效率。6）实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，进步得率。7）用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。