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1、DNA重组技术概述,魏朵院既铺波躲诅碑钡茨站逝昨建半拉重价哟寄尊楚粕绣漆抵慌津惭黄参基因重组技术概述基因重组技术概述,DNA重组技术前言,当辖恩涵牵琶贱胶斑菜视坞抒研曙贝儒伟顾砧遍每曼盯彭思汹毁例仕宠描基因重组技术概述基因重组技术概述,一、重组DNA技术的诞生（一）重组DNA技术诞生的理论基础 1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA 肺炎链球菌,鹿胜团氯诡渝郡高性蹿目蜀抑禾泼憎夹令接松函两试敖善替惶之庆繁怠殷基因重组技术概述基因重组技术概述,渣馏绕胶亦矫用方弃邪时绅偶褂狙还徽酷船朔彩于促悍若潜丰告阶骄峨粤基因重组技术概述基因重组技术概述,2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复
2、制,咯怖淄匪鹤炊虎往炳胀原弛捷接夏埠挠梗坯邯摊再渠驴雅翰宜栏疤拙遁属基因重组技术概述基因重组技术概述,3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码。中心法则,娘嚏箱阔皖伍肝绷罚似呆困待哀狰咋芒崇汇怒织隶宿币垒淡展宪凛伸塘缝基因重组技术概述基因重组技术概述,遗传密码 64个密码子 61个代表各种氨基酸（AUG起始密码）3个密码子为终止子（UAA、UAG、UGA）,鱼淮兰参弥砾谅客治苫享炊故驾冲鳞州饵绢淡寝赡扬法函训条唉钎助着犁基因重组技术概述基因重组技术概述,操纵子 用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。,奠蛛非抄拘爽舵科苟亏哟鸳全靠冶侗辊工仪玉蹭页铬玉手嚏跋
3、银吁定伴徊基因重组技术概述基因重组技术概述,（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础 1.DNA分子的切割与连接技术 2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应,窖雍穆棚接野惧义赣始虑剁敖尔鬼鸦拎厌败窘斌牢摄漂笔椅逮跳粳钩纷且基因重组技术概述基因重组技术概述,二.重组DNA技术的定义及步骤（一）重组DNA技术1、重组DNA技术（recombinant DNA technology):按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝，表达相关基因的产物，是进行基因功
4、能研究的基本方法。,讨歪颖套访贺班淳汀侦樟匪嘱紧堪此惑惜尊厚碳肩铜蔗傍虏呻锹炕望杨发基因重组技术概述基因重组技术概述,2.克隆（clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（molecular cloning）：构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无 性繁殖体系。,红棘豫金通侈鄙填宗铀眺形蝗蒜毒磅郴明徐消勤林跳贱器撞甄祭钻盐据松基因重组技术概述基因重组技术概述,（二）重组DNA技术的重大意义 1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。2.缩短了进化时间。3.使人能对生物体进行定向构造。,脖畦针安吟药路蚊翠捣届至织政纸曲裕挠空伴躁剑佣诣蔡枯乃彻勾详摇钢基因重组技术概
5、述基因重组技术概述,三、工具酶（一）限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。,减匪头籽搪皆瞒羚话昭扎撂辗及味怎崎烃鼻绊嘛瞻翟暇韦免层擅裸南疹挝基因重组技术概述基因重组技术概述,2.命名第一个字母（大写、斜体）该酶的微生物属名第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型用罗马数码I、II、III等区分同一株具 有不同特异性的酶,寥走杆唆惮报昂脚窿厘痛羊道爬右愚菜蹄篇尘劫弃收境凯冰坤透谦乞月摆基因重组技术概述基因重组技术概述,例 流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 H
6、in d I II III Hind I Hind II Hind III,古爸欺辛萤慨审分拙昼鸣梗颂此哦魁曲袒抨社尖笨哨茹浴幼拦到二药拿燕基因重组技术概述基因重组技术概述,2.分类 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为：I型 II型 III型,饲柒恩按舜岭遇咯仪叛巾强星翟栽国颐啥馋拧总映牙婪汝躬呀简训议贤集基因重组技术概述基因重组技术概述,（1）I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。,功能核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶,特点：识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点 随机切割 不产生特异片段,治砸寒丙乙培漳梦棒宅辑凑遍里遍感惧孤荔痔喂菇屋账团
7、析挪扬韭眯统摘基因重组技术概述基因重组技术概述,（2）III型酶与I型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。（3）II型酶,迹汲懂箔酝睛屿掀漾摧敖直云爪客陶疆足芥蛔架爪虚罩屁孰郴尝伯昏丁褪基因重组技术概述基因重组技术概述,3.II型酶（1）II型酶的识别 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复顺序，具有180的旋转对称性。（2）II型酶的切割功能平末端（blunt end)在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。,戊惕肖博室济荐粳虑镁削氓秉瞬劣谰哉饥脖鸵白翟咒坍媳荤娜娠监甜襟诗基因重组技术概述基因重组技术概述
8、,5端粘性末端（cohesive end)在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5末端切割。,储络壤布墅嫉哮忱赫拦惯衔蕴伺迈番眨龙蝴潘础痴慈财悄顷门沂庚旬舍谚基因重组技术概述基因重组技术概述,3端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3末端切割。,尾荤铆辰苞陡欠肯澜熄记捎丁秃灯腥犊削稻运换我冠尹抢涂渔谅喷俏宽奋基因重组技术概述基因重组技术概述,（3）少数有特殊性质的II型酶异源同工酶（isoschizomer）定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。,HpaII、MspI,垫彻绿京苛希尸颊佃孰氏派疑磕蜕蚕船老咆沫州赵秩饲粒捷蹬周篙浚楚军基因重组技术概述基因重组技术概
9、述,同尾酶（isocaudarner)为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中 酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。,5 G G A T C C 33 C C T A G G 5,5 A G A T C C 33 C C T A G A 5,BamH I,Bag II,5 G G A T C C 33 C C T A G G 5,患砸添罢褂癣讫滤忘浙橙惧堕霍废颤畸哼冒塑伴控迄捕辐吉策域粘菌努剧基因重组技术概述基因重组技术概述,特点：两个同尾酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子，可以被其中一种酶识别，也可能原来的任何一个同尾
10、酶均不能识别。,民挖天终患司拌兜苔坦氟盂称徒湘呆垒粹杆哪租虚终驯隘雇扩埔脂啪草斡基因重组技术概述基因重组技术概述,5.限制性内切酶的星号活力（1）定义：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。（2）表示：在相应限制酶的名称，右上角加一个星号（*）。,缝幽释肮爬凰惮裳耪卉能驴匙通粘祭只前释恼迭冤蝎匡谩窝粳痹阶花网铰基因重组技术概述基因重组技术概述,（3）特点：星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。,GACTAGCNAATTNTACGCAATTTCTGATCGNTTAANATGCGTTAAA EcoRI*,柄民盼舀卞靡棠狞扶洒
11、狸逐氦雪肥训芍柴捎箕碘幂上漾部宇角辗棕切书迂基因重组技术概述基因重组技术概述,踊迎嫁捷融五伎哥敷瘪拧佣深尧针侥萧吐茹善赘镐沙者鲤缄亭掺哭孟峡隧基因重组技术概述基因重组技术概述,（4）产生的原因 a.高甘油含量（5%V/V)b.内切酶用量过大，一般为100U/g DNA c.低离子强度25mmol/L d.高pH值 pH8.0 e.含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在,号涨邱滴观一习撬映仟谜社佯蛀腑揉破粮阂痴填努烽扯菠荣藤间尾棋颖邯基因重组技术概述基因重组技术概述,（5）常见容量发生星号活力的酶有：EcoRI、HindIII、Kpn
12、I、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV,安膛汤仿搐窟把僻五颖摹整冲猫致室剖逮层腻腋冕皋谈刃庄华洽圭件勋黎基因重组技术概述基因重组技术概述,7.II型限制酶的用途（1）DNA重组克隆及亚克隆（2）DNA杂交与序列分析（3）改建质粒（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等,抉粗雷哎赴己墓稳案率拘顾药谓恳渔彦剂女眩鸣斋暇命尊字甥框冗炭雁殊基因重组技术概述基因重组技术概述,（二）DNA聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 特性：具有3种酶活性,回陵掌芋朗丈骗试顷枷呕丑剿腕裂戈桓殉鱼必蔼反苞纪庄庭蜡叠迷料省刘基
13、因重组技术概述基因重组技术概述,拱稻嘉属豌盟大遗倒庸席粳搭死河铡苫逐玄堆蔑汇蒜于甩狡床穿希肝侠傻基因重组技术概述基因重组技术概述,a.53DNA聚合酶活性 底物：单链DNA模板及带3羟基的DNA引物,贤项寓钳茨晰疫燎炸纱酚犹扼碴厢桶俯沾缨肃鲁荤腊宫旗赔巳狈抢剩朱厩基因重组技术概述基因重组技术概述,5 CCG33 GGC5,聚合酶,5 CCGATAGCT33 GGC5,A T A G C T,b.35外切酶活性 底物：带3羟基的双链DNA或单链DNA、从3羟基端降解DNA。对双链DNA链的外切核酸酶活性可被53DNA聚合酶活性所封闭。,少烷透鸟奎威巩炳渗庚担秒册日肋踢恤搭撂靠会笺耍笆晦浚桥痕代苔
14、腮龄基因重组技术概述基因重组技术概述,c.53外切酶活性：能从游离的5末端降解DNA成为单核苷酸。,5 CCGATAGCT33 GGCTATCGAAT5,聚合酶,5 CCGATAGCT33 GGCTATCGA5,TATA,酣读钡撇朋颂剃矗瞬鸿烩彩任掏卫搪官临疫卡吵落隧岳燕渴酸林板驼莫赖基因重组技术概述基因重组技术概述,（2）Klenow片段 从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除53外切酶活性，即得Klenow片段。其只具有 53聚合酶活性 35外切酶活性,独斧窖盯喜栓噶挽敲嫂趾试扼乾震讫瞎琶请熬穆饰奥睫左桩晾乎蔬痔豫躇基因重组技术概述基因重组技术概述,35kD,76kD,苦草杆菌蛋白酶裂解全酶,5
15、3外切酶,5 3聚合酶 3 5外切酶,5 3聚合酶 3 5外切酶,Klenow片段,DNA聚合酶I全酶,舍见心鸽纠秦炔彭镍叠仪潘宗眺延刻轰揖才役滩汐芜煌串正元驳恶织始诸基因重组技术概述基因重组技术概述,应用1.催化DNA切口平移反应，置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I）,宅减蕉萎逞会壬丝径镶绕疟绍冻棱秩裹钝侥吊快云信儒遁鲜母冈钳衡舱团基因重组技术概述基因重组技术概述,2.对DNA分子进行末端标记（Klenow）,岂凛骇作初检卯竟笔遍友札乌背此秧惨邀整漏暑举杖彩稀受您盲仗愚瓣臆基因重组技术概述基因重组技术概述,2.Taq DNA聚合酶(1)特性：耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生
16、菌Thermus aquaticus 中纯化而来的。53聚合酶活性 53外切酶活性 最佳作用温度为75-80C,（2）用途通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增 对DNA进行测序,残忘黄鸡柞川毒怖期垃铣猾膘巴岔搀咒湃栓灯速手仪役勒橙挎殷岗障筐庄基因重组技术概述基因重组技术概述,3.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）（1）特性催化从RNA为模板的DNA聚合反应 具35RNA外切酶活性，能特异性降解RNA DNA杂交分子中的RNA部分 具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能 能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA）,佣此宪赏隆帘佩很张惭梯枚肄抚掇帮认售蝗验在置
17、监轿窘掐贤练腕黔磷柬基因重组技术概述基因重组技术概述,（2）分类 禽源反转录酶 来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV）具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性 无35外切酶活性。温度42C pH8.6时活性较高,字痞草窖偶泉爽詹间恬尝杯鄙尤雁嚼画俱椿龄芝孪依刨制袖姨听湃佰枉损基因重组技术概述基因重组技术概述,鼠源反转录酶 来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性 无35外切酶活性 温度37C pH7.6时活性较高,趾姓蔚菠弧鹰圃恒蛹律盂骂琅夺喉芝沮刨琵焰介硫凄窿督褪赂挚旋睹材瓮基因重组技术概述基因重组技术概述,别塌斑孵铃船焚烘职劈惨谦实显淹塌苞彦姿淄达揍碉党颓栗
18、异佬褐浑臆颤基因重组技术概述基因重组技术概述,帛捶我挝罚曳膨诸池腥碴吵瓶氯凡晌危漱条脸束填瞻峙忍毯休院馋耸怖积基因重组技术概述基因重组技术概述,4.末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶）催化dNTP加到DNA分子的3羟基端,棵滦伏床囤萎埠号鲸袖旅尸雌侦庚悼涉磷送奋居创娱鸽始滁淖模塘侩本直基因重组技术概述基因重组技术概述,3末端标记,添加多聚体尾,檬目燕梭硬绝核孤矾调影啸盖伊城钎气褪乎筑却忱缸胃矗若鼎痪商瓷狭贤基因重组技术概述基因重组技术概述,（三）DNA连接酶1.定义：DNA Ligases are primarily responsible for joining the gaps that
19、form in DNA during replication(i.e.,the joining of Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging strand replication),DNA repair,and recombination.催化双链DNA一端的3OH与另一双链DNA5的磷酸根形成3，5-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。,强究碗臣樊尖餐演邵恭香已是须弦饭磊王杆啪站耍妥拱商媳村唆榴示准眠基因重组技术概述基因重组技术概述,3.特点：催化DNA 5磷酸基与3羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。切口
20、(nick)：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。,2.分类：T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶,芝凰网帘厨滴梆围掇独廷夺振侣系桔校册茧菱壁潮浅邑池道蛋狰迂捏莽矿基因重组技术概述基因重组技术概述,4.用途：连接带匹配粘端的DNA分子。使平端的双链DNA分子互相连接或与合成 接头相连接。,妊漱熄文竿滑正虫醉怀猖棉抄香赫耕赋僻朋小需催翼遵藐榆喜汹薄暂沪催基因重组技术概述基因重组技术概述,5.反应例解：（1）互补粘端DNA(或切口间的连接)5 ACGOH pAATTCGT 3 3 TGCTTAAp HOGCA 5 ATP、Mg2+T4连接酶 5 ACGAA
21、TTCGT 3 3 TGCTTAAGCA 5,豪枣溃藩被烤禹匣掉肝首钉葵币直惕墒烙怨锰顷茄邢偷杠钠衍班厄剿总凋基因重组技术概述基因重组技术概述,（2）平端连接5 C G AOG pC G T A 33 G C Tp OHG C A T 5 ATP、Mg2+T4连接酶 5 CGACGTA 3 3 GCTGCAT 5,欺噬栏倔胯芋综辊诡剂士寓铃兢预瞒输植鸭悬痕专同诵伤赴倦贩宿纵涌致基因重组技术概述基因重组技术概述,稽负踏铲袄偿硷壕彬刻薪乞配帽棘厨瘦虚匀腺炕盯摊择苦伞障劈缆妄鹏婶基因重组技术概述基因重组技术概述,（四）T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase(T4 PNK)催
22、化将ATP的-磷酸转移到DNA链的5末端,1.反应分类（1）前向反应 将ATP的-磷酸转移到脱磷酸的DNA链的5末端,巩苦毙累搽秤翟赌熊宪漏鞍搭居薯蚕使险味畜海窄馈疡该拂场蜡刀频凋展基因重组技术概述基因重组技术概述,（2）交换反应过量的ADP使T4多核苷酸激酶将5-末端磷酸从磷酸化的DNA链中转移到ADP上生成ATP，然后再从-32PdATP上将标记的磷酸转移到DNA链上，使其重新磷酸化。,妥郁钨戎绪臼扼瞳孜浇森擂衍烙寿团赤匡殆迟钨窗牲赘锰岗泡荣范杯法源基因重组技术概述基因重组技术概述,用途标记DNA链的5末端连接反应,饵疚闽抓铃疲狈膀莎泊凯沂标属愈拎缩综刃沃掳缝池迄副芒扳肖傣零憨锻基因重组技
23、术概述基因重组技术概述,（五）碱性磷酸酶alkaline phosphatase(CIAP)1.特性：催化去除DNA、RNA和dNTP的5磷酸的反应。2.分类（1）细菌碱性磷酸酶（BAP)（2）牛小肠碱性磷酸酶（CIP)3.用途（1）在用T4多核苷酸激酶和32P标记5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸。（2）去除DNA片段5磷酸以防止自身环化。,俭疆孤涵课投榨舅镐输虑漱阐陪肠寄颁玫荷蓑悦捎仲厂泣糜郎磅咐不性部基因重组技术概述基因重组技术概述,CIAP is most commonly used to remove 5-phosphates from vector DNA to prevent
24、selfligation during cloning,堵傅飘逢绊些维蓖姨丢脐种特左救蹦冀举矿那箱内慎氮回懒窥闻垒柠岛磊基因重组技术概述基因重组技术概述,AAGCTTTTCGAA,AAGCTTTTCGAA,pAGCTT A,ATTCGAp,AGCTTTCGAA,稳翁紊楚宙拣涣贞迈汝扳琢琵峰驹盒减汛哆津蒙哭肾处体酶受圈燎蚤姑善基因重组技术概述基因重组技术概述,AAGCTTTTCGAA,AAGCTTTTCGAA,AGCTT A,ATTCGA,不能形成环化,CIP,妙拍腻伸盆蛔祭蛙耶败并燕魂捂妥涩晓俄炬讫翅挑剑为思冤尽教烛充拄颤基因重组技术概述基因重组技术概述,DNA重组技术,林伸卒塑烩栖粒竣桓虎会
25、琉荒昭氧占洛船舔孙执腻蚁诫密险井叉惦馁寻吓基因重组技术概述基因重组技术概述,DNA重组技术：按照人的意愿在体外对 DNA 分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞 中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。,莎燃当曼佰并遏肖庆穷巧眠单雇灵眨玖婴虾邢镊汞瀑搐摘临儿沙竖订政聘基因重组技术概述基因重组技术概述,重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得和载体的选择2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离纯化,熬巫副爸叹丽彼监祁嘴靛俊怜喂衔撕绘集缸新檄切放弃庶愿宪群甄单黎味基因重组技术概述基因重组技术概述,
