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1、第三部分 样品预处理方法,一、概述：1、样品处理的目的 气相色谱 高效液相色谱色谱分析技术 高效毛细管电泳 平面色谱 气相色谱质谱 联用技术 液相色谱质谱 液相色谱核磁 气相色谱红外,石化过程分析 工业卫生调查和评价 药物动力学和毒理学研究 食品分析 法庭取证分析色谱法应用 医疗诊断 核能和燃料分析 制药过程监测 化妆品和香料组成分析 商品质量检验,样品预处理的目的,除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护,2、样品处理的必要性和重要性,色谱分析的全过程包括：样品采集、样品制备、色谱分析、数据处理与结果表述 样品种类繁多，其组成、浓度、物
2、理形态等均是色谱分析测定的影响因素。样品处理技术就成为提高分析测定效率、改善和优化色谱分析的重要环节,占样品分析时间的比例（60%）样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性 最差的环节影响实验结果好坏 的最重要因素,是决定性的步骤,3、样品处理的原则,（1）样品中可能存在的物质组成？浓度水平？（2）样品中的主要组分？（3）采样方法是非破坏性的还是破坏性的？（4）收集的样品必须有代表性。（5）采用方法必须和分析目的保持一致。,3、样品处理的原则（续）,（6）样品制备过程中尽可能防止和避免待测定组分发生化学变化或丢失（7）样品处理中
3、，若进行待测定组分的化学反应，则反应应是已知的和定量完成的。（8）样品制备过程中，要防止和避免待测定组分受到污染，减少无关化合物引入制备过程。,3、样品处理的原则（续）,（9）处理过程应简单易行，所用样品处理装置的尺寸应与处理样品的量相适应。（10）采样后应尽可能快的进行分析样品的制备和分析，或使用适当的方法消除可能产生的干扰，做好样品的保存。,二、样品的采集,气体（包括蒸汽）涉及的样品形式 液体（包括乳液）固体（包括气体悬浮物、液体悬浮物）直接采集主要采集方法 富集采集 化学反应法采集,直接采集：只需将样品直接引进容器中，所用容器最好是新的或洗净后干燥的，以防止其他样品的残留影响。富集采集：
4、是在采集过程中，同时将待测组分富集，如吸附采样中选择合适的吸附材料，在吸附的同时使待测材料在吸附材料上富集,使用采集方法的注意事项,（1）采集的样品应具有代表性，要注意采样的时间、地点及采样位置的选择。（2）所有样品都要采集双份，一份分析样品，一份保存样品，备复查时使用。（3）样品的采集和储存过程要作记录，详列采样时间、地点、准确位置等。,（4）采集储存中待测组分不应有损失或发生化学变化。损失包括挥发、在储存容器上的吸附等物理原因 化学变化包括被氧化、微生物引起的分解、各组分间的化学反应等（5）避免样品受到外界污染。（6）采集后要尽快进行分析样品的制备和分析。,三、样品预处理常用的方法,高速离
5、心过滤、超滤选择性沉淀萃取索氏抽提衍生反应加速溶剂萃取（ASE）浓缩样品 液-固萃取/液-液萃取固相萃取样品小柱,样品预处理的过程,去除微粒,过滤可重复使用过滤装置/过滤膜有机(0.22m)/无机(0.22 m)膜片可更换一次性使用的膜使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000 rpm,超 滤,机理超滤是一种基于分子量分离的技术目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐,选择性沉淀,常用于生化样品中除蛋白有机溶剂：乙腈、甲醇强酸：三氯乙酸、过氯酸盐：50%硫酸铵,样品衍生,提高检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外
6、检测的灵敏度增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子氨基酸分析,加速溶剂萃取（ASE）,ASE 是用溶剂对固体、半固体的样品进行萃取的技术ASE 的原理是选择合适的溶剂、通过增加温度和压力来提高萃取过程的效率ASE 可用来替代索氏提取、超声萃取、手工振摇、煮沸法和其他萃取方法,三种不同型号的ASE,ASE100,ASE200,ASE300,ASE的突出优点,快速，15分钟溶剂用量少萃取效率高样品基体影响小可同时选用四种溶剂萃取安全，全自动ASE建立了环境,药物,聚合物,食品,和化妆品工业的大量应用,ASE工作流
7、程,加溶剂 时间(min)0.51,加样品,静态萃取 5,氮气吹扫12,溶剂,泵,吹扫阀,炉体,氮气瓶,静态阀,收集瓶,萃取池,循环,加热 5加压,萃取结束 Total(min)准备分析1218,新溶剂冲洗0.5,食品安全评价中ASE的应用,水果和蔬菜中的农药动物组织中的二噁英和多氯联苯粮食中的农药粮食中的毒枝菌素熏肉中的多环芳烃葡萄干中的杀真菌剂咸肉中的硝酸盐/亚硝酸盐一些正在发展的方法,ASE的应用领域,环 境,农业、食品,聚合物,制 药,浓缩样品,浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/固相萃取小柱,固相萃取（SPE）技术,固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产
8、品，分离复杂样品中的不同组份固相萃取技术（SPE）的重要性实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本提高分析的准确性及回收率更容易自动化 减少样品处理步骤降低对不稳定样品的影响 提高安全性,SPE小柱,SPE 小柱的应用领域除去杂质及干扰组份把样品分成不同极性的组进行分析富集微量的组份SPE 小柱的主要种类反相正相离子交换,SPE小柱的种类,根据SPE小柱的种类及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 第一步：让所感兴趣的样品留在小柱，杂质通过小柱 第二步：用不同极性的溶剂，使所感兴趣的样品通过
9、小柱,SPE小柱使用方法,准备,进样,萃取,萃取,各种SPE小柱（一）,正相使用方法可先用6到10倍柱体积的非极性溶剂平衡加入样品用非极性溶剂洗脱不想要的组份用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如NH2/CN确认回收率,各种SPE小柱（二）,反相使用方法可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了样品溶解在强一些极性的溶剂中加入样品用强极性溶剂洗脱不想要的组份用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份确认回收率,各种SPE小柱（三）,
10、离子交换使用方法可先用6到10倍柱体积的去离子水或弱缓冲液平衡，样品溶解在去离子水或弱缓冲液中加入样品用弱缓冲液洗脱不想要的组份用强一些缓冲液（改变pH或离子强度）洗脱第一组感兴趣的组份用更强的缓冲液洗脱剩下的感兴趣的组份确认回收率,SPE小柱的方法开发,SPE方法开发的几个关键因素文献查阅流速控制同色谱理论：以10ml/min润湿小柱，15ml/min加载样品离子交换填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加载样品以15ml/min流速洗脱样品注意样品本底的不同注意载荷量及加样方式,四、生物样品的制备技术,植物：花、叶、茎、根、果实 体液：尿、血液、唾液、胃液、胆汁等生物样品 动物 毛
11、发 肌肉 组织器官：心、肝、肺、脑、胃、肾、胰腺等 微生物,生物样品中需分析的组分：植物体内营养成分、农药残留等 动物体内药物及代谢产物、糖类及有关化合物、脂类、维生素、核甘、核甘酸及其衍生物、磷酸酯类化合物、固醇类化合物、氨基酸、多肽、蛋白及其衍生物、某些生物大分子,生物样品中待测组分存在的形式及处理方法,待测组分存在于体液或细胞外时：用萃取的方法提取、浓缩制备样品 用沉淀的方法除去干扰组分（蛋白质、DNA、多糖）待测组分存在于生物细胞内：破碎细胞，释放待测组分，再用萃取或沉淀等方法制备样品,1.生物样品的采集,采集生物样品时注意事项：（1）注意样品的代表性、典型性和适时性（2）注意采样部位
12、的准确，特别是动物的组织器官，一定要认准（3）生物样品一般都有一定的生物活性，样品采集后要立即处理（4）生物样品的采集大部分可以在实验室内进行，采样工具要消毒，最好在无菌的条件下采样,2.细胞的破碎,根据样品的不同，采用不同的破碎方法：动物的胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软，用普通的匀浆器研磨肌肉及心脏组织较柔韧，要先绞碎再作成匀浆植物组织用一般碎磨法含纤维较多组织则必须在捣碎器内破碎或加砂研磨对具有坚韧细胞壁的微生物，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法。,细胞破碎方法的分类,3.生物大分子的提取,提取生物大分子样品时条件的选择：（1）溶剂 常用的溶剂有水、稀酸、稀碱、稀盐等，
13、也可以采用不同比例的有机溶剂，如：乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳 选择溶剂时要注意物质的溶解性，如极性物质易溶于极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂；温度升高时一般溶解度相应增大；远离等电点时溶解度增大,（2）pH值 在稳定的范围内，pH选择在偏离pI的两侧 注意测量pH值的准确性，误差不应超过0.1（3）温度 一般提取温度在5以下 除此之外，还应考虑溶剂的离子强度、介电常数等对提取效果的影响,4.蛋白质的去除,（1）加热法 前提条件：待测组分热稳定性好，而其它易产生热变性 该法最简单，但只能除去热变性蛋白,4.蛋白质的去除（续）,（2）盐析法原理：利用不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降
14、低来沉淀去除蛋白质常用的中性盐有：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠影响盐析的条件 盐的饱和浓度 pH的选择 蛋白质的浓度 温度的影响,4.蛋白质的去除（续）,（3）有机溶剂沉淀法蛋白质的沉淀和溶解与溶剂的介电常数有关常用的有机溶剂：乙醇、丙酮（4）等电点沉淀法原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低，用酸、碱调pH值，使蛋白沉淀出来缺点：蛋白沉淀不完全,4.蛋白质的去除（续）,（5）膜分离法 膜分离技术：超滤、反渗透析、电渗析、微孔过虑、气体渗析、超精密过虑等 超滤法的特点（与沉淀法比较）适用于小量样品 适用于对酸碱不稳定的样品 待测物质结合在膜上，影响回收率 超滤膜的材料：醋酸纤维素、聚酰
15、胺、聚砜等,4.蛋白质的去除（续）,（6）凝胶层析原理：利用分子大小不同的物质 在流过凝胶固定相时的保留时间不同，分离待测的小分子化合物和大分子蛋白质。（7）柱层析原理：用能吸附蛋白质的材料装填成小柱。使含蛋白质的样品流过，样品中的蛋白质被柱填料吸附，而待测组分则流出小柱。,4.蛋白质的去除（续）,（8）高速离心原理：根据物质沉降系数、质量、浮力因子等的不同，应用强大的离心力使物质分离、浓缩、提纯的方法。,5.微透析技术,微透析技术：实质上是一种膜分离技术，它利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术。,应用一：三聚氰胺测定样品预处理,固相萃取柱：阳离子交换固
16、相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基 苯高聚物，60mg，3ml,或相当者。处理方法：使用前依次用3ml甲醇、5ml水活化。,样品：液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等,处理方法：称取2g试样于50ml具塞塑料离心管中，加入15ml三氯乙酸溶液和5ml乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25ml，一移取5ml滤液，加入5ml水混匀后做待净化液。若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除酯后再用SPE柱净化。,净化：将待净化液转
17、移至固相萃取柱中。依次用3ml水和3ml甲醇洗涤，抽至近干后，用6ml氨化甲醇（5%）洗脱。整个固相萃取过程流速不得超过1ml/min。洗脱液于50 下用氮气吹干，残留物（相当于0.4g样品）用1ml流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。,应用二：血清和尿中厚朴酚与和厚朴酚 的提取,厚朴酚、和厚朴酚是木兰科植物厚朴干皮、根皮、枝皮的主要成分，作用是抗菌、抑制胃溃疡和防止应激性胃功能障碍、抑制血小板聚集、抑制中枢神经系统和降血压等作用。,0.5 ml 血清或1 ml 尿 分别加入0.5 ml 甲醇，离心 取上清液0.5 ml 加入 0.1 mol/l 的冰醋酸 0.1 ml
18、 摇匀 用乙酸乙酯和乙醚混合液（v/v为1:1）2 ml 萃取 离心后，取1 ml 有机相置尖底试管 在45 水浴中用氮气流吹干 加入HPLC用流动相 0.1 ml 分析样品,五、导致待测物损失的因素,吸附：原因之一：玻璃表面或橡胶塞会吸附药物，特别是脂肪胺类及含硫化合物。解决方法：可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性 非极性提取溶剂中加入少量极性溶剂可减少器皿对药物的吸附。,原因之二：血样中红血球和纤维蛋白元凝块的形成，常能引起待测物的共沉淀。解决方法：将全血样品加入缓冲液后再行提取。这样血球散开，药物可从血球表面解吸，以减少共沉淀的损失。缓冲液的一定离子强度，可蛋白质变性时形成疏松的絮状物，这
19、样可减少药物的物理性滞留和共沉淀的损失。,化学降解：原因：样品的化学和生物学不稳定性常引起化学分解 光化学及热稳定性（尤其在净化步骤中强酸、强碱的中和所产生的热）引起的损失，也应加注意。解决方法：尽量采用温和条件制备样品，经免引起药物的部分分解、开环等情况发生，有的样品尚需避光操作,衍生化反应：由于不完全反应，待测样品仅部分转化为所需的产物或形成副产物有时在蒸发除去过量衍生化试剂时，使得衍生物与溶剂形成共沸混合物而导致损失,络合：某些样品会与重金属离子络合，这种情况虽较少遇到，但往往是某些样品制备中损失的一个因素。,蒸发：有的是药物本身的挥发性（如苯丙胺）因蒸发所得残渣未能完全溶于所加的小体积
20、溶剂中因减压浓缩引起溶液暴沸而导致损失在吹氮过程中使样品以气溶胶形式逸出。,六、样品沾污,增塑剂 测定发现某些塑料血样采集管含有3-(2-丁羟乙基)磷酸酯等，可使溶剂提取步骤中药物分配系数变化、方法变异系数增大（从5%增至20%）。脂肪酸及酯类 血样中浓度约为350g/ml（10-3mol/L），较待测药物高102103倍以上,易被提入。常出现在色谱图中。,溶剂中杂质原因：由于溶剂体积较其它试剂为大，即使原来杂质浓度较低，浓集时或通过色谱柱时，浓度显著增大而干扰测定。更严重的是干扰物在每批溶剂或试剂中有所不同，而影响不同实验室间、各分析人员间的实验结果。解决方法：采用高纯度溶剂（价贵）溶剂在使
21、用前重新应用全玻璃仪器重蒸馏采用专属的检测方法。,化学衍生化带来的杂质 由于试剂未经纯化致使色谱分析中往往呈现额外的杂质峰。实验环境和器皿、材料的污染 实验室的去污剂、润滑油、滤纸、玻璃器皿不够洁净，蒸馏水纯度不够等。,例：乳制品中提取三聚氰胺可能产生的污染,所有待检样品和实验器皿避免接触塑料（它有可能滤过三聚氰胺），会造成污染。样品处理的时候，塑料中的三聚氰胺会被溶解出来，导致假阳性的结果 三聚氰胺粘性很强，一切重新使用的玻璃容器都需要用乙腈水溶液清洗过。,由于三聚氰胺的粘性很强，容易与塑料粘在实验器皿上，塑料器皿则更甚会导致回收率偏低的情况发生避免这种干扰的最好办法是彻底清洗。样品操作过程中，比如离心管，可以在取出上清液后，再加1%三氯乙酸清洗23 次，目的是清洗管壁和残渣，清洗液并入上清液。固相萃取的最后一步，洗脱，可以将6ml 的5%氨水甲醇液分次沿壁添加，可以3ml2 次或2ml3 次，目的是清洗管壁和残渣，清洗液并入上清液一次性针式过滤器也是要留意的器材，且切记要用续滤液进样测定。,
