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1、第二章 样品的采集与处理,一项分析工作一般包括下列步骤：（1）试样的采集和制备；（2）定性检验；（3）试样的分解；（4）干扰的消除；（5）测定；（6）分析结果的计算和评价。,第一节 样品的采集和保存,在定量分析中往往用样本平均值来估计总体平均值。这就要求进行测定时所使用的分析试样具有高度代表性，即样本平均值能代表总体平均值，否则，分析结果再“准确”也毫无意义。总体：分析对象的全体 样品：从总体抽出的一小部分样品 采样：从总体中抽出样品的操作过程。,一、样品的采集原则,原则：代表性、典型性和适时性。1、代表性：代表总体，各个方向分别采集，2、典型性：针对典型样品，有目的。例如：参假食品的检测。是
2、事件应对中必采的样品。胃内容物是确定摄入中毒的最好检体，尿是分析非挥发性毒物的较好检体；血液是最重要的毒物检测样品，3、适时性：有时间概念，例如：发生食品中毒应及时赴现场采集。,对化学事故（或中毒事件）可供采集的样品有现场样品（环境、食品、化学品及其它用品等）及患者的生物材料（血、尿、胃内容物、组织）。采样时机可以选在事发现场救助时、医院抢救和治疗时、甚至在病人恢复时，某些中毒甚至可在事件发生后数十天仍有可能采集到有价值的样品。现场遗留的食物、化学品、盛装的容器是首先应采集的样品,采样时应避免样品污染和被测组分的损失选择合适的采样器具和采样方法详细完整记录采样环境至少采集两份样品，用于分析和保
3、存,二、样品的保存,1、密封保存法2、冷藏保存法3、化学保存法存放容器的选择存放容器的清洗存放时间,三、各类样品采集方法简介,（一）、空气样品：气体样品为均匀样品。可采用直接法和浓缩法。1、直接采样2、浓缩采样：（1）、溶液吸收法。（2）、固体吸附剂阻留法。（3）、滤纸膜阻留法（4）冷阱收集低温浓缩采样装置：收集器，流量计，采样动力,(二)水样（三）食品 随机抽样、系统抽样、指定代表性样品（四）生物材料 生物介质(biological matrix)包括全血、血浆、血清、尿、毛发、唾液和各种组织。其中最常用的生物样品是血液和尿液。,1.血样的采集供测定的血样应能代表整个血药浓度。若能从动脉或心
4、脏取血最为理想，但只能用于动物，不能用于人。动物采血可根据不同种类及实验需要，采取适当的方法。如大、小鼠可由尾动脉、静脉、心脏、眼眶取血或断头取血等，家兔可由耳缘静脉、颈静脉等多处取血，犬可由前、后肢静脉等处取血。对于受试者通常采用静脉取血(成人从肘正中静脉取血，小儿从颈外静脉取血)。静脉取血一般将注射器针头插入静脉血管抽取。抽取的血液转移至试管或其它容器时应缓缓压出，以防血细胞破裂。全血在加肝素或柠檬酸、草酸盐等抗凝剂后，离心分取血浆，其体积约为全血的一半。血清则是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血块凝结而析出，离心取用，而血块凝结时往往易造成药物吸附的损失。,全血直接作为样品时，也应加入抗
5、凝剂混匀，防止凝血。对大多数药物来说，血浆浓度与红细胞中的浓度呈正比，所以测定全血不能比测定血浆提供更多的信息。而全血的净化较血浆与血清复杂，尤其是溶血后，血色素等可能会给HPLC测定带来影响。但是，一些药物可与红细胞结合，或药物在血浆和红细胞的分布比率因人而异，在这些情况下，宜采用全血。血样抽取量受到一定的限制。人体药代动力学研究需要在多个时间点(一般为1220点)取样，每次由前臂静脉取血35m1。随着高灵敏度测定方法的建立，取样量可继续降低，从而更易为受试者接受。实验动物取血量应注意是否超过了动物的生理承受能力。,制备血浆样品时，将采取的血样置含有抗凝剂的试管中，缓缓转动试管使其充分混合、
6、离心，所得上清液即为血浆。常用的抗凝剂有肝素，它是体内正常的生理成分，因而不会改变血样的化学组成或引起药物的变化，一般不会干扰测定。通常lml血液采用20个单位的肝素即可抗凝。可将配制好的肝素溶液均匀地涂布在试管壁上，于6070烘干备用。其它抗凝剂有柠檬酸、草酸盐、EDTA等，但它们可能引起被测组分发生变化或干扰某些药物的测定。制备血清样品时，将采取的血样在室温下至少放置3060min，待血液凝固后，以30004000r/min离心10min，分取上层澄清的血清。,2.尿样的采集尿药测定主要用于药物剂量回收、药物代谢及生物利用度研究，也可用于乙酰化代谢和氧化代谢快、慢型测定等。因为尿药浓度通常
7、变化较大，所以应测定一定时间内排入尿中药物的总量，这就要同时测定在规定时间内的尿量(体积)及尿药浓度。尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基，因而需立即冷藏或防腐处理，否则细菌会很快繁殖而引起尿素分解，产生氨气，这在夏天进行得很快，除产生异常气味外，还有可能导致样品分解。冷藏条件一般可置4冰箱内。若欲在室温下保存，应在收集尿样后，立即加入防腐剂。常用的防腐剂有甲苯、氯仿或改变尿液的酸碱性，以抑制细菌的繁殖。加入的防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应，应由实验验证，以便选取合适的防腐措施。在所有体液样品中，尿样最容易获得，并且样品量大，取样次数可以增加，内含药物(母体药物
8、及代谢物)浓度高。健康人的尿液中不含蛋白质，不需除蛋白，所以常用作药物体内代谢研究。,3.唾液样的采集由于某些药物在唾液中的浓度与血浆浓度密切相关，即可利用唾液中的浓度反映血浆中的药物浓度。由于唾液样品采集时无伤害、无痛苦，取样不受时间、地点的限制，因而样品容易获得。一般成人每日分泌唾液11.5L。唾液的比重为1.0031.008，粘度是水的1.9倍；唾液的pH在6.27.6之间变动，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH。通常得到的唾液含有粘蛋白。唾液的采集应尽可能在剌激少的安静状态下进行，采集前应漱口，除去口腔中的食物残渣，唾液自然分泌流入收集管中。采集后离心，分取上清液作为药物浓度测定的样
9、品。也可采用物理方法(嚼石蜡片等)或化学方法(广泛应用的是柠檬酸或维生素C等，有的将约10mg柠檬酸结晶放在舌尖上，或者将10%的柠檬酸溶液喷在舌上，弃去开始时的唾液后再取样)刺激，使在短时间内得到大量的唾液，但这样可能影响唾液中的药物浓度。,唾液中的粘蛋白决定了唾液的粘度，它是在唾液分泌后受唾液中的酶催化而生成的。为阻止粘蛋白的生成，应将唾液在4以下保存。如果分析时没有影响，则可用碱处理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存过程中，会放出CO2，而使pH升高，需要测定唾液pH时，应在取样时测定较好。冷冻保存的唾液解冻后应将样品混匀后使用，以免产生误差。只有知道唾液中药物浓度与血清中药物的总
10、浓度有一定的比值时，唾液中药物浓度的监测才有意义。,4、毛发：是许多重金属元素的蓄积库，含量比较固定可以记录外部环境对肌体的影响。头发能反映肌体短期内的物质代谢，也能反映不同阶段的代谢情况。头发易于采集，便于保存。采集的方法：取枕部距头皮25cm内的发段，重量12克。5、组织：死尸最好在2448小时取样。,第二节 样品的处理,一、样品处理的目的血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析经常采用的样本，其中尤以血浆最为常用。因为药物在体内达到平衡状态时，血浆中药物浓度一般与药物在作用部位的浓度密切相关，可以反映药物在靶器官的状况。进行HPLC分析时，生物样品一般都需要进行纯化处理。对
11、纯化程度的要求，取决于使用的分析方法及样品所含杂质情况。仅有少数情况下可取样品直接进样，对于大多数样品而言，进行预处理是必要的。,样品处理时要求：,1、必须分解完全，不能造成被测组分的损失2、样品不能被污染。3、试剂消耗尽可能少4、样品处理器皿应与样品量相适应,二、样品处理方法,样品溶液制备 游离态溶解法 水溶法：水溶性成分 酸性水溶液浸出法：在酸性水溶液中溶解度增大且稳定的成分 碱性水溶液浸出法：在碱性水溶液中溶解度增大且稳定的成分 有机溶剂浸出法：易溶于有机溶剂的成分,结合态分解法 全部分解法无机成分 干灰化法（1）高温灰化，450550。（2）低温灰化，高频等离子体技术。湿消化法 硝酸、
12、硫酸、高氯酸、高锰酸钾、过氧化氢 硝酸硫酸消化、硝酸-高氯酸或硝酸-过氧化氢消化 硝酸-硫酸-高氯酸消化,密封加压消化法 密闭罐消化，防止挥发性元素损失微波溶样法部分分解法有机成分 酸水解、碱水解、酶水解 eg：食品中结合态脂肪的测定,常用的分离与富集方法 溶剂萃取 固相萃取 固相微萃取 超临界流体萃取 蒸馏与挥发 膜分离,溶剂萃取：液-液萃取，液-固萃取，液-气萃取原理：物质在互不相溶的两相中分配系数不同决定因素：物质的疏水性和亲水性,分配系数 KD：溶质在两种互不相溶的溶剂中分配达到平衡时，该溶质在有机相中的浓度与其在水相中的浓度之比KD 越大，物质越易溶于有机溶剂中分配比 D：分配平衡时
13、，溶质在有机相中总浓度与其在水相中的总浓度之比萃取百分率 E%：物质被萃取到有机相中的百分率，也称萃取回收率D值大的萃取剂有助于提高萃取效率,萃取体系：简单分子，螯合物，离子缔合物，溶剂化合物萃取条件的选择溶剂：分配比D大，较高选择性，和水的比重相差较大，无毒或低毒，沸点低溶液酸度：对物质存在形态有较大影响其他试剂：适当螯合剂，配位剂等萃取操作：分液漏斗,固相萃取原理：样品中被分离组分和其他组分与萃取柱中固定相的作用力不同SFE超临界流体：易溶解其他物质，易进入样品基体内常用超临界流体：CO2蒸馏：常压，减压，水蒸气挥发：顶空，气体萃取,膜分离法：透析，超滤，液膜原理：选择性渗透动力：外界能量或化学位差样品衍生化处理原理：通过化学反应将样品中难以检测的组分定量的转化成另一组易于检测的组分目的：扩大分析方法使用范围 提高分析方法的灵敏度,
