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1、样本DNA提取、纯化、保存方法,一.DNA种类：,真核生物DNA、细菌DNA、病毒DNA、质粒DNA细胞悬液DNA、组织DNA,双链环状、双链线性、单链环状细胞核DNA、细胞器DNA,二.提取DNA总的原则：,1.保证核酸一级结构的完整性；2.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；4.其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。,三.DNA样品准备,1.生物组织：,最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70或液氮,液氮冷冻敲碎研磨组织匀浆法液氮匀浆法,2.培养细胞,悬浮生长细胞：1500g离心，410分钟收集细胞
2、单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集,3、血液样品,血液抗凝易用柠檬酸抗凝液（ACD）：柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加H2O 至 100ml 每6ml新鲜血液加1ml ACD液，0保存数天，-70长期贮存。,四.DNA提取,1.酚抽提法：,先用蛋白酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯仿抽提，最后乙醇沉淀。获DNA大小为100150kb,2.甲酰胺解聚法：,破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。可得DNA 200kb左右。,3.玻璃棒缠绕法：,用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒
3、在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。,4.异丙醇沉淀法：,基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）。,5.表面活性剂快速制备法：,用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,6.加热法快速制备：,加热法快速制备：加热96100，5分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。,7.碱变性快速制备：,先用NaOH作用20分钟，再加HCl中和，离心后取上清，含少量DNA。,五、DNA的浓缩,1.固体聚乙二醇（PEG）浓缩：,用透析袋外敷PEG至合适量。,2.丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水
4、可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。,3.乙醇或异丙醇沉淀：,（1）需要阳离子盐的存在 NaAc最常用，NaCl对含SDS样品好，NH4Ac去除dNTP好，LiCl沉淀RNA好，但不能用于反转录前。,（2）沉淀温度与时间 0，1015分钟。,（3）离心 04，12000g，10分钟，小于100bp DNA需超速离心,4、精胺沉淀法 与DNA结合后使DNA结构凝缩沉淀，需在无盐或低盐溶液。,六.DNA的鉴定,1.分光光度法,在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.751.80。低于此值表明制备物中留有蛋白质成份或酚。高于
5、此值表明有RNA的残留量。,2.凝胶电泳分析,(1).影响琼脂糖凝胶DNA 迁移率的因素,A、DNA的分子大小 分子越大迁移速度越慢,B、琼脂糖浓度 迁移率与浓度成反比琼脂糖含量（W/V）线性DNA分离范围（Kb）0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-3 2.0 0.1 2,C、DNA构象 相同分子量的超螺旋环状（型），切口环状（型）和线状（型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率型型型,D、电压 迁移率与所加电压成正比，但过大有效分离范围变小。2Kb DNA,电压5V/cm。,E、电场方向 单一方向速率均等，改变方向
6、，极大分子DNA迁移更慢。通过脉冲电场凝胶电泳分离极大DNA。,（2）.DNA的检测,A、用溴乙锭染色,在254nm紫外光下检测，如需回收最好在300nm紫外光下割胶，否则易脱嘌呤而断链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。,B、用银染法,Ag+与DNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高200倍，但不能回收。,（3）.分 析,通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳，经比较可获知DNA标本大小。如条带拖尾，系加入DNA量太多或凝胶未制好。如分子量小或一片糊状，表示DNA有降解。,为了判断目的DNA片段的大小，常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外
7、灯下很快知道目的片段的大小。最常用的分子量参照物是 Hind 消化物，各片段的大小以bp表示，分别为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。,（4）.DNA回收,A、电泳到DEAE-纤维素膜 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带DNA都到膜上，取出洗下。,B、透析袋电洗脱 切下条带的琼脂糖凝胶，放 透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后回收。,C、低熔点琼脂糖凝胶 切下胶，加热到65熔化胶，然后用酚抽提回收DNA。,七.DNA的定量,1.分光光度法：,测定DNA在A260nm的光吸收，计算浓度A260稀释倍数50 g/ml(双链DNA),A260稀释倍数40 g/ml(单链DNA)A260稀释倍数20 g/ml(单链寡核苷酸DNA),2.琼脂糖平板法：,在含溴乙锭琼脂糖平板上滴15l样品DNA和已知浓度标准品，放置数小时后比较检测。,3.微型凝胶电泳：,将样品和标准品同时电泳、染色，比较荧光强度。,八.DNA的贮存,1.短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA，pH8）缓冲液中。,2.长期贮存：在70乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70保存。,
