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1、PCR引物设计流程（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）一.流程图确定模板来源1物种）搜集，保存模板序列分析模板保守区域 嘶进）绘制引物设计示意图璋图）Primer 5设计引物Qlig。分析引物何省略5设计第一条引物Blastn检测特异性对照保守区域确定引物设计引物扩增完整模板区域世瑟绘制引物设访示意图根据实验结果调整引物二.确定模板1. 确定模板来源物种 近亲物种：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等常用物种：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗）爬行类（鳄，龟）， 两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选
2、择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以 下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。2. 利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列A.进入 NCBI 主页 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选定搜索范围为 “Gene”，关键词为 “PHIP”，得 到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索 时都可使用）。Filters: Manage Filtmm 树状图VTaxonomic Groups ffListj vertebrates (146) maminals (&S) pbcentals
3、 (84) iTarsupials (3) mcniotrernes (1) birds 例)Passe-ifomnes (1&) Falronifonnes (4) GruifcrmeE (3) Pelecanir&rmes (3) Psittaziformes (2 Gallifbrmes (2) 5pheni5ciforme5 (2) m&re. (14) bony fiEhes (8)Cprinodcntifbnnes (2) m&re. (6) turtieE 3) lizsrds (2) Crocodylia (2) amphibians nrtilaoinous fishes (
4、1) coelacanths (1)GenepfPHIPfsym |弟国SrcFiAdvanced搜索范围挥词Display -Qttingg! M Tabular, 20 per page. Sorted by Relevance腿旭tex M搜索结果 Filters activated. Current oil/ Clear all to show 147 items.ylts: to 20 of 结果数Aliasesr PhipID： 31 5843plecstrn homology damain interacting protein RaffcrsNorway ratiChnomos
5、ome 8. NC_C0507.4 90337339 .90433364. complementRGD1564964基因别名Nainfiie/Gene ID DescriptionLocation0 phipID:569727plecsti n hom&logy damain irteracting protein Dario rrio (zebrafish)Chromosome 23.NC_00713d G 31349444.31420072complement FHFID:55023clear0 PhipID:339466J2870pleckstm homology damain inte
6、racting protein 威ts must涵ns (house mouse)2810D04D21Rik46324MOOGRk Ndrp, Wdr11brwdl im.ri4roi0si dkey-2G1l7.3物种名plecst十叩门可伊racting proteir-pb/no smpieg (humanjoChnomosome 5,BRWD2: DCAF14NC_00300S.12WDR11, ndrp(78934419 79078294.,c 口门pEnt：基因定位信息Chromosome 9 NC_CQQ叮上5(B2B66159.82975700complement)Search
7、B.点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/about/。田RefSmsnnaintBiirwd in dEDEndEntly of Annotated Genomes独立于注释基因组的参考序列，具有数据库来源，多为实验扩增所得，可靠性高 田RefSmstifAnn湎拍d Genomes: Hom。sapiens AnnctatiDn Releas
8、e 1。6来源于注释 基因组的参考序列，为计算机预测所得可靠性较低 NCBI Reference Sequences (RefSeq)C.需注意：对于同一基因的mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量选择同一异构体（一般选择最长的异构体）。I PREDICTED: Mus musculus pleckstrin homology domain interacting protein (Phip) transcript|yariantyj| mRNANCBI Reference Sequence: XM 006511564.2FASTA Gmphic：sD.如需得到该基因所
9、在基因组的序列信息（如扩增启动子区域时），在基因报告页面上部Genomic regions，transcripts，and products条目下，点击Go to nucleotide选项下FASTA按钮可进入基因组（组装）序列页面。Genomic Sequence: NC_000006.12chromosome 6 reference GRCh38 Prima Assembly 日Go to巳柜即。巳sequence也询悟Go to nucleotide: G叩hie】GenBank Genomic regions, transcripts, and productsF怂TAE.在基因组（组
10、装）序列页面中，默认仅显示跳转前基因的序列，在Change region show条目中修改设置为Whole sequence得到基因组序列，在Send选项下保存即可。Graphics也play &国ingg：回 FASTAHomo sapiens chromosome 6, GRCh38 Primary AssemblyNCBI Reference Sequence rb：_O0DC06.- 215592: 7CC782!?,L-7B9jdChicken Gallus gallusatggggaggaaaaagatccagatccagcggatcacggatgagcg cttgatgaaga
11、aagcctacgagctgagcgtgttgtgcgactgcgtgttccagt atMlim musculus NMJCK) 10S121 &. 1 .txt眦件PHP.titXenopus tropicalis XM_O02936206.2.t.三寻找保守区域 保守区域的意义：基因的保守区域是指不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小。在扩增基 因序列时，选择在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因。因此，在引物设计前需先找出目的序列 中的保守区域。在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物。1. 制作mega标准序列A.用ClustalX软件打开整理好的TXT文件（菜单
12、File Load Sequences）,然后在菜单Alignment选项下选择Do Complement Alignment，此时将保存两种格式文件：.dnd和.&比（序列较长时耗时较长，需数分钟）。,GGTGGGTGGGTGGGTGGGTGFile Edit Aligninent Trees Colors Quality HelpH ClustalX (1.83)Multiple Alignment Mode Font Size:T1 Complete Alignment j|ChickenHuirianMouseRat RattiasCattle|TGGGGflGGAAAAAGAqAGA
13、TVAG|G4Tatggggaggaaaaagatt|agatwag|gaatATGGGGAGGAAAAAGATT|AGATAGiGAilj atggggaggaaaaagattiagaag|gaati |tgggg!ggaaaaagattiagatcc|agcgaaiiOutput Guide Tree File:Output Alignment Files：Clustal：ALIGNCANCELG:协列集.dnd10_2G：呼列集.alnB.将以上.aln文件用D AMBE软件打开（FileOpen standard sequence file）,注意选择恰当的序列类型。打开后的文件可直接
14、转存为.meg或.fas格式文件（FileSave or Convert Sequence Format） o注1:此时在Sequence Info对话框应选择Binary选项，否则在转换格式时T碱基会被替换为U。阻 Sequence InfoC BinaryL Non-pratein Nuc. Seq.L Amino Acid Seq.(* Protein-coding Nuc. Seq.理 Data Anal/sk in Molecular Biology and EvalutionFile Edit Alignment Sequences S-eq. Analysis Ph|Standa
15、rd (Trans：_Tble=1 102030StandardDuckChickenXbiiopusHumanMusZebrishATGTCGTCTCTCAACAACCAGCACAGCACCATGTCTTGTGAGAGGAAAGGCCTCTCGATGTCTCGTGAGAGGAAAGGCCTCTCGATGGCTGCTGAGCGTAAACACGTCGCGPHIP.FAS文件S：吨寄on/FASTA*.FASMEGA Files (lIntel liGenetics.Pear&on/FASTA*.FASDPAML七PMLJGenEanlcGCG single sequence formatGCG
16、multiple sequencefo-rmat MVISF)PHVUP r.PH)EMBL/Swi&sPr&t (*.EMEJDNAStrider (*.StrJFitch C*.FitPIR/CODATA C.PIRJPAUP/NEXUS *.MEXPJERFKumars PHVLTEST (*.SbQ一5眦菊竺,2. Mega分析同源性A.用Mega软件打开以上保存的.meg或.fas格式文件，新建一个序列对齐分析窗口(AlignEdit/BuildAlignmentTRetrieve sequences from a file)。MEGA 5.10(511019)B.在新窗口中以默认设
17、置将序列集进行序列对齐分析(AlignmentTAlign by muscle (Codons),结果保存为.fas 文件(Data Export Alignment)o脾M5: Alignmen-t Explorer (PHIPS.MEG)Dais Edit Search Aliqnrnent Web Sequen cer Diplsv wrI工 QJU c， jatccm 恤| w WNA SequencesTranslated Protein Sequences |SDScias/AbbiT T11 一 guk. GhickEH3. Xisn口 pum4. Huma n5 . MumZe
18、brishJATGTCGTCTCTCACfiA-CCAGCACAGGACCGA ATGTGTT-GT GAGAG-GAAAGGCCT GTGGGA ATGTCZC-GT GGfiG-GAA.GGC-CT CTCGGA ATGfiCIG-CT ffGCGI AA.ACAG-GT CGCGCC.打开网址 http:/mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py#forms:boxshade 进入在线软件 BOXShade,在选择文件按钮下载入以上已对齐的模板.fas文件。Run ResetBOXSHADE 3.3.1printouts from multiple-alig
19、ned protein or DNA sequencesadvanced optionsAlignment FileEDIT CLEAR|迭择文件佳选择文件0 洞心xiiiT 1 jri-TxA-Tj. JL. jHl 1 ijjTlt 1 11 xi1-.- 1xj.1-J ij. t . t j. iVij.! 1x_-iXCllj.- J 1 J.-JtJ. ijjTl-J x_- J 1 xiJ 1 J- JV iXCllj. 11 t.Cllj.t-.t 1 .T 1 J TijjTllj. LjrLLJ.1.- TXJ.-T XJ-LJ.T 1 TjTlQ_Cl 1 -T.Cl.-
20、 -t xGCGGGATCTGG TAGCTTGGAGTCGAAGGGTGGTAGTACCCGAGCTATCAGCTGGTGTAGCCAGTAGGCAAGAAGAATGGAGAACTGCAAAGGGAGAAGAAGAAATAAAGACTTACAGGTCAGAAGAGAA *AAGAAAACACTTAAC-TGTTCCAAAAGAGAATAAAATACCCACTGTCTCAAAGAATCATGCTCATGAGCATTTCCTGGATC TIGGAGAATCCAAAAAGCAACAGACAAATCAACACAATTATCGTACAAGATCTGCATTGGAAGA 11GAC TCC TAGACC
21、C TCAG AAGAGATAGAAAATGGCAG TAG TTCTTCAGATGAAGGCGAAG TAG- T TGC TG TCAG TGG TGGAACATCCGAAG AAG AAG AG AG AGC AT GGC AC AG TG-一ATGGCAG T TC TAG TGAC TAC TCCAG TGAT TAC TC TG 虻 TGGACAGCAGATGCAGG-AAT TAA TC TGCAGCCACCAAAGAAAG T TCC TAAGAATAAAACCAAGAAAGCAGAA,Author(s): Hofmann, Baron点击advanced options按钮展
22、开选项，将默认设置进行如下图修改。其余选项保持默认即可，也可根据实际需要进行调整。设置完后点击Run提交任务。注2： should sequence name be printed项的默认设置为YES，此时将把序列名同时打印。需再输出的富文本文件中将字体全部改为中文字体，才能保持序列的对齐。如需英文字体，此项可以改为no,序列名可以通过其他方式添加。口 Output parameters* Output format R.TF (Rich Text Format (4) 卜 |Should sequence name be printed Yes 曰Display ruler line Yes
23、 1 Sequence propertiesSpecial label for similar residues YesjlSpecial label for identical residues in all sequences Mo 日Display consensus line Yes 叩在软件输出结果的报告页面中保存.rtf格式的富文本文件，该文件可用Microsoft Word编辑。resultsRich text foirmat output file boxshade.rtf , JI 二目难This fil巳 c日门门qt be dim口I日yed in bQws，Cliful
24、l s-creen3. 保守区域的分析如下图，consenus行表示序列间的一致性，*号表示在序列间完全一致的碱基，.号表示在序列间高度相似 的碱基，空格表示在序列间；consenus行之上每一行分别代表一个物种的PHIP基因序列，蓝色背景的碱 基为在物种间保守的碱基。首先观察consenus行，*号比例在50%以上且空格很少的区域可视作保守区域， 具体分析中应灵活处理。以PHIP基因为例，保守区域可划分为：190-1240bp，1260-1980bp，2000-2290bp， 2540-4920bp， 5340-5740bp。注3：出现连续的长的不保守区域（大于数百bp），因为引物设计产物的
25、最佳长度上限在1000左右。此时 可以只考虑近亲物种序列的保守性，降低保守区域的分析标准。ckU不保守的区域ChickenXenopusHuiDanMus ZebrishAGAGAGAGAG保守区域DuckChi c：k 已口XenopusHumanMumZebrishconsensLiEATTATTATTATTATTTTAGGACACATTTTGGGACACGAAGTTAACAACCACCGGTCGCTT590600ACTGlTCATTTGTACTGlCCTTCCTTCTTACTGIIGTACTGCGTCCccTTTAGGACACCTTTCCTCTGGACACirTGTCTGGACACGGG
26、ACACCTGTCC|CGGIGIACTGlc|Jgt|tactgcgtcaccttcgacGATGATCATC550560570580完全一致序列较 少。但高度相似的 序列只在一两个物 种中有突变不保 守的序列只存在斑 马鱼一个物种内。Duck Chicken. XenopusHumanMus Zebrish consensus265026602&T02&S026902700此段出现连 续1000余碱 基的不保守 序列，引物 设计时无法 跨越.因 此只考虑 近亲物种鸭 和鸡的序列 进行保守区 域的分析nDuckChickenXenopusHumanMusZebrishcons已nmum481
27、04320 48304840485043604870 4SS04890 4900 4910 49204.绘制引物设计示意图 引物1 * 引物2 引物3 引物4 |*Tr U11u12-2I1192290046800000JI2 22 59 4 0 0PHIP基因编码区扩增示意图14 9 2 0引物51J TAA553 74 400不保守区域保守区域注4:对于PHIP基因，我们顺利的得到了保守性区域分析结果。但是，对于某些进化较快的基因，保守性区 域可能不足够用于设计引物。此时，可以逐渐减少用于分析的远缘物种，采用渐进性的分析，直到得到能够 设计引物的保守性区域。注5:为什么是mega ?保守性
28、区域的分析用其他软件（如DNAMAN）也可进行。采用mega的原因在于其分析 方法的可靠性更高，同时该软件在进化分析等中也非常常用，所以将mega可读序列的制作一并说明。四. 用Primer5软件设计引物 1.新建文件，导入模板确定一条序列为设计引物的模板序列。本例中根据进化关系，选择鸭的PHIP基因序列为模板。在Primer5软件中新建一个窗口（File - New T DNA Sequnce）,将模板序列粘贴（ctrl+v）在窗口内（一般选择as is表示粘贴原序列，也可根据需要粘贴反向序列等）。2.设置参数，搜索引物在新序列窗口中点击在引物设计窗口中点击Search按钮进入引物搜索窗口，
29、如下图。引物类型为PCR Primers，搜索类型Prirnpr 、.、.、一I按钮进入引物设计窗口，如下图。一般选择成对引物，在搜索范围内限制搜索上下游引物的序列区域（参考前面的保守区域进行设置），产物长度，引物长度设置详见后续介绍。搜索模式分为自动的Automatic和手动的Manual，在自动模式下引物搜索由严格标准往宽松标准执行，直至引物条数/对数达到设定值，其搜索参数设置如下图，搜索参数为在搜索过程中排除不合格引物的筛选条目；在手动模式下，可设置搜索的严格程度，并可修改搜索参数条目下的限定数值。Search CriteriaSearch Fo-r:弓I物类型(* PCR Primer
30、s Sequencing Primers C Hyb-ri di ration Probes游引物为主 以适合下涛引物为主Search TV*:Sense Primer 上潇引物C ComptibJe with Sense Primer 以适合上Anti-sense Primer 下涛弓lr ComfMitiblle with Anti-sense Prim erBoth上下满引物都携素汗Pmi倡成对引物Primer L-engtli;引物长度Search Rang-es;Cerise Primer:Searcli Mode:?搜素模式 AutomaticC ManualSearch Para
31、meters设置搜素参遗CancelV Help在引物搜索窗口设置好后点击按钮开始搜索，搜索结果如下图。在搜索结果中可分别查看上下游引物或成对引物的情况。Rating值代表系统对引物的（产物）打分，分值越高说明引物越优秀，但并不是绝对的评价标准。引物具体信息在点击引物所在行后在引物设计窗口显示，其中:Primer:EE按钮为选择显示Seq NoLengthTim 性GC%AG kcalsAnolActivity 邮DDegen 巳 racyTa Opt gSeq No表示引物第一上游或下游引物信息；个碱基在序列中的位置；Length表示引物/产物长度；Tm表示引物/产物的爆解温度；GC%表示引
32、物/产物的GC含量；&表示引物结合模板过程的自由能；Activity表示引物与结合的效率；Degeneracy表示引物的多义性；T a Opt表示Primer5软件建议的成对引物扩增时的最佳退火温度。HairpinDirnerFalsePrimin-gCtoesDimern表示引物可能形成的二级结构；Dimer表示引物自身可能形成的二聚体；False Priming引物与模板的错频；Cross Dime引物间可能形成的二聚体表示o以上项目即为分析引物时的参考条目，引物设计的一些原则整理见后续。参照引物设计的原则即可根据Primer5中上述参数对引物对进行选择。& Search Results,
33、匚Sense匚 Anti-sensec* =Paiirsj1M) pair* found.& Pnnwr Premier5r GCGrCCACCGASCAT 311111111 III 1111113T ACMTHGATACSTCAGGTGGCTCGTBHCiCCINTSlAACAMLAGCaCTTrTGATTT虽CCTTTHJVJGTCTGAACTTGCGCAA 5i i i i | i i i i I i i i i |V N Y -G S_d _l i i i I i i i i| i i i I i i i i| i i i ii i i i| i i i i I i i i i| i
34、 i i i I i i i i11 i i I i i i i| i i i i I i i1 3 40a&O13S0 270 3S0 39D 4C0EPSIVDTLFS & ELNG KyRLE aLRatingSeq NoLengihTim rqGMA G IkcalEJrrDlAcUvitDegene racyTa opt FCJISense跑3321651.262.S-lA1Anti-sense107051.4显5-32J34.61Product75739ST J：44.251.4HairpinDimerFalsePrim in gDiiirnerNo Hairpins Found”
35、11SeriscHone| Fern闭 |Anti-senseNoneNoneFoundJ2d另，对于一些引物，可能出现大多数指标都较为优秀，但个别指标严重影响扩增反应的情况。这种引物可使用按钮，手动的对其进行修改以提高其性能。3.引物设计原则1）引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于75C，即Taq酶的最适温度。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物 长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它 退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模
36、板的速率越小。2）产物长度:扩增片段长度取决于酶的活性和保真性能。对于普通Taq聚合酶，PCR产物一般不超过2000bp， 而在100-1000bp范围效果较佳，超过1000bp的产物就可能出现产物量降低甚至无法扩增的情况。对于其 他酶，应根据相关说明使用。3）引物Tm值：引物的Tm值，指的是50%的引物分子和其互补序列表现为双链时的温度，PCR时的退火温度 一般都要比Tm值低5C左右以确保有效退火。引物的Tm值一般控制在55-65度，一般需保证上下游引物 的Tm值差不超过4-6度。如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温 度。许多软件可以对Tm进行计算，其计算
37、原理各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。4）GC%:有效引物中（G+C）的比例为40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提 高PCR的特异性，GC含量太高也易于引发非特异扩增。上下游引物的GC含量不能相差太大GC%对扩增的 影响主要通过Tm值来体现，当Tm值符合要求时，对于GC%不必做严格要求。另，引物序列中同一碱基连 续出现不应超过5个。5）引物3端：引物3端是延伸开始的地方，最好不存在错配。同时3端不应超过3个连续的G或C，因 这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。同时，3端有形成二级结构/二聚体的可能对于PCR扩增的影 响将大于5端。在扩增编码
38、区域时，引物3端最好不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易 发生简并，会影响扩增特异性与效率。6）&值：引物5端和中间&值应该相对较高，而3端&值较低。AG值是指DNA双链形成所需的自 由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，AG值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间 G值相对较高，而3端AG值较低的引物，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。引物3端的AG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应（寡核苷酸3末端最后5个核普酸的稳定性 小于一9 kcal/mol，通常就是专一性的探针或引物）。7）引物的二级结构/二聚体：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成
39、发夹状结构，这种二级结 构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。另外，尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基 互补，否则两个引物分子可能通过互补碱基而结合形成引物二聚体。一般情况下，引物形成的发夹结构和 二聚体中不应多于4个连续碱基的同源性或互补性（实际常用自由能AG判断，AG为负值时，其绝对值 越大不利影响越大，一般以小于绝对值4.5为标准（应远小于引物与模板结合的G），为正值时则几乎无 影响）（Oligo分析时的一般标准则为引物效率小于100或小于目的产物效率的三分之一）。个人观点认为， 引物的二级（发夹）结构对于目的片段扩增的不利影响要大于引物二聚体（因为引物位置的二级结构在模 板
40、序列中是同样存在的。模板序列形成二级结构，在PCR过程中如果无法完全解链则将直接导致引物与模 板结合的失败）。8）引物5端：可以有与模板DNA不配对碱基。其应用有：5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位 点5端加上适当数量的保护碱基），5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突 变以作研究，5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）等。因此，在无法避免的情 况下，引物5端的出现的错配在一定程度上可以接受（也用自由能& 判断，标准与“引物的二级结构/ 二聚体条目相同）。4. 保存引物通过File -Print可以保存引物的报告文件.pdf （需安装虚拟打印机）。注6
41、:以上是Primer 5使用的基本流程。更详细的说明参照本文相关文件夹内“Primer Premier 5. 0中文使 用说明书”文件。注7：部分资料中对于引物形成二级结构的预测提到了用单独的软件进行检测（如RNA Structure）。该软件 可在其官网网址免费注册后下载http:/rna.urmc,rochester.edu/register.html，也可在线使用http:/ /rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/。其使用说明可参照官方网站，也可参照本文相关文件夹内R NA Structure 3.2中文使用说明书”文件。注8:在引物设计软件中，
42、Oligo软件也是一款很常用的软件。其软件的使用技巧，详见本文相关文件夹内“使 用Oligo 6和Primer Premier 5.0等软件设计PCR引物”文件。一般情况下，单独使用一个软件已足够；本 文建议使用Primer搜索和筛选引物后，备选引物在Oligo中逐一分析。注9:引物设计是一项复杂的工作，限于篇幅和时间等原因，本部分的介绍还很粗略。在本文相关文件夹内 “引物设计相关论文”文件夹中有一些关于引物设计的论文（大多选取来源于CSCD等数据库的优秀期刊）， 是对本文内容的补充。同时，大家也可以自行下载和搜集更多的论文和资料，希望有精力的同学可以继续完 善和提升本文。五. 用NCBI Blastn程序比对引物目的：检测设计的引物是否在其他非目的基因（模板）上存在非特异性的结合。1. Blastn的使用由网址 http:/blastncbinlm.nihgov/Blastcgi?PROGRAM=blastn&PAGE TYPE=BlastSearch&LINK LOC=blasthome进入Blastn在线程序。在Enter Query Sequence条目下输入或粘贴备选的引物序列。 NCBI；blast wastn suiteStandard Nucleotide BLASTbl
