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1、,流式细胞术原理和应用,张 国 平,生物医学研究院心血管研究中心,2009-6-4,主要内容,流式细胞仪概述 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪的应用 检测的一般步骤,一、流式细胞仪概述,流式细胞仪种类,BD FACSVantage,BD-Calibur,Epics Altra,Epics Altra Beckman Coulter,流式细胞仪的定义,流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。,利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通
2、过这些特性对细胞或颗粒进行定量。检测表面标记物 检测胞浆标记物 检测胞核内标记物 检测可溶性蛋白,流式细胞术,（FLOW CYTOMETRY）,流式细胞仪的基本结构,特殊的显微镜,高速测定细胞，大样本计数 检测稀有细胞 多参数分析 自动化 细胞分选,流式细胞仪的主要特点,二、流式细胞仪工作原理,流式细胞仪工作原理,流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。,仪器
3、基本组成,流路流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5105-1106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMT HV电路放大电路HV及GAIN 增益A/D转换统计 计算机,流路,流动室,流式细胞仪光路图,流动室,激光配置,488nm氩离子激光器633nm氦氖激光器大功率水冷紫外激光器,光路-滤片特性,长通滤片 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片(dichroic filter),630 nm Band
4、Pass Filter,White Light Source,光信号收集,光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。,二色镜 1 2 3,带通滤波片光电倍增管,激光束,细胞,收集透镜,前向散射光,侧向散射光，荧光,数据处理,FSC SSC FL1 FL2 FL3,对数 线性 线性 线性 对数,脉冲处理，模数转换,光信号,电信号,记录数据，显示结果,（面积，峰高，宽度）,颗粒度,细胞大小,流式细胞仪产生的信号,非荧光信号,FL1 FITC,GFP(PMT2)FL2 PE(PMT3)FL3 ECD,PI(PMT4)FL4 PC5,APC(PMT5),荧光信号,细胞表面的抗原(或细胞膜受
5、体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。,原理,488nm空冷激光：FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、PerCP、EGFP、EYFP、AO、TO、Fluo3,633nm空冷激光：APC、APC-CY7、CY5,90-4水冷激光：UV（333-364nm）HOECHST 33342、DAPI,三、流式细胞仪应用,流式细胞仪应用,淋巴细胞免疫功能测定 干细胞研究 细胞增殖与凋亡检测 细胞周期及倍体分析 细胞活性分析 细胞分选,淋巴细胞亚群活化的T淋巴细胞抗原特异性免疫细胞调控性T细胞树突状细胞先天免疫细
6、胞,细胞免疫功能测定,细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 细胞因子受体
7、CD25 CD115 CD117 CD122 CD126,CD抗原及其相关细胞群,淋巴细胞亚群数量检查项目和意义,用荧光标记抗体,抗体特异性地结合细胞上对应的抗原,表达该抗原的细胞被标记上荧光；抗原表达多的细胞荧光强度强,阳性细胞百分比或浓度,靶蛋白浓度,淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测,造血系统干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞神经干细胞脂肪干细胞,干细胞研究,热门研究(肿瘤)干细胞,肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST 33342染料摄取方面有重大差别故流式细胞仪
8、是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具,干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。,肿瘤干细胞中的研究应用-Hoechst 33342 side population,Hoechst,Hoechst+Vera.,Side Population Cells,细胞凋亡研究,1.鉴别凋亡与坏死:Annexin/PI2.测定凋亡率:Annexin、Apo 27、TUNEL3.研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasL bcl-2/bax4.多参数分析
9、凋亡是趋势,G1,S phase,G2,M,G1,1,2 1,DNA含量,DNA 含量,细胞周期时相,G0/1,G2/M,S,细胞数,细胞周期分析,PIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI(UV excitable)Hoechst 33342(viable,UV excitable),不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发,为脂溶性，主动进入细胞UV激发,常用的DNA 染料,DNA含量及细胞周期分析,细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以
10、得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M.,流式细胞仪分选,电荷式分选是当前的主流分选模式高速分选是保证结果的基本条件高纯度和高活性是分选的基本要求可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）提供多种分选流动室光路稳定，紫外激光功率大流式分选和磁珠分选的差别和联系,电荷式细胞分选,细胞分选的主要技术指标,分选速度：25000个细胞/秒 分选纯度：98%分选后细胞存活率：97%,Before S
11、orting,After Sorting,三、流式细胞仪检测的一般步骤,设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果,检测的一般步骤,电压调节利用同型对照：设置背景,电压 volts增益 Gain,设定阴性和阳性信号强度的临界点,荧光补偿,Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence.,FITC520BP,PE575BP,4 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5,补 偿,淋巴细胞,单核细胞,中性粒细胞,如何看流式图,PIAnnexinV细胞凋亡检测,PI,Annexin-V,Thank you,
