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1、流式细胞术Flow cytometry，FCM,1.流式细胞仪(Flow Cytometer):是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。2.流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。,基本概念,第一节 流式细胞仪基本结构与原理第二节 流式细胞术的数据分析第三节 流式细胞仪分析的技术要求第四节 流式细胞术的应用,一、流式细胞仪基本结构与功能 二、流式细胞术的重要术语 三、流式细胞术基本原理 四、流式细胞术的样本设置,第一节 流式细胞仪基本结构与原理,四、流式细
2、胞术的样本设置,1.常用对照阴性对照阳性对照空白对照补偿对照2.一套完整的流式细胞术检测样本设置,阴性对照,作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，将仪器归零，即确定待测标本的基础荧光域值免疫球蛋白同型对照（同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白。反映待测标本对抗体非特异性结合的 水平）阴性细胞对照（用已知不表达某种抗原的细胞进行平行实验，通常用于确定抗体的特异性）,阳性对照,即用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）细胞进行平行实验，通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性。,空白对照,即不进行标记的细胞。有些细胞内物质会同样被激发而产生自发荧光。空白对照的主要作
3、用用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。,补偿对照,由于光谱的重叠，对于多色分析样本必须设置补偿对照。补偿对照主要用于多色分析时荧光光谱重叠的补偿调节。补偿对照是将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并作适当调节。,2.一套完整的流式细胞术检测样本设置,流式细胞术的基本原理是利用细胞标记前后的荧光强度改变来确定细胞性状，故一套完整流式样本即要有用于确定其基础荧光域值的对照（如空白对照或阴性对照），又要有已标记的待测样本。一套完整的流式样本设置可根据其不同的标记方法进行如下设置。直接标记样本 对于单色样本应设置空白对照、阴性对照（同型抗
4、体对照）和待测样本。对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。间接标记样本 对于单色样本应设置空白对照、阴性对照（一抗同型抗体对照）和待测样本。对于多色样本，在单色基础上另加补偿对照，一般不建议使用。,三、流式细胞术基本原理,1.流式细胞术分析的基本原理2.流式细胞术分选的基本原理3.流式细胞仪荧光补偿设置,1.流式细胞术分析的基本原理,前向散射与侧向散射是细胞的固有属性，暂称为物理属性。荧光信号是人们通过不同手段将荧光物质结合在细胞上，是人为属性，暂称为化学属性。,R1：淋巴细胞R2：单核细胞R3：粒细胞R4：红细胞裂解碎片和少量血小板,将目的细胞群圈定（即设门），然后将门内细胞以FS
5、C或SSC为横坐标，荧光信号为纵坐标的散点分布图表示出来，此图中细胞会出现在与其FSC或SSC相应的位置，并只可能表现两种情况：荧光信号弱或无、荧光信号强或有。,调节电压可改变目的细胞的荧光信号强弱，那么如何判断特异性荧光信号的有无？需要设置阴性对照以确定细胞自身基础荧光域值，并通过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。,首先通过调节电压将阴性对照细胞的基础荧光域值调至阴性致信区内，然后对阴性置信区进行界定，大于阴性置信区的荧光信号为特异性荧光信号。对于流式样本来说，设置阴性对照是必须的，且阴性置信区一旦设定，将作为后续样本的阴、阳性判断的基础，不能随意变动。,2.流式细胞术分选的基本原理,
6、1.分选速度：几千个细胞/秒2.分选纯度:99.5%左右 分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。3.分选收获率:90-95%分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。,3.流式细胞仪荧光补偿设置,以FITC、PE双色分析为例：（1）先调节阴性对照管（即同型对照IgGFITC、IgGPE）：先将原补偿清零，通过调节电压，使阴性群落在FITC和PE双阴性区。阴性对照的作用是，调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。,（2）FITC标记抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照)此时电压已通过阴性对照设定，绝不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时，补偿便是正确的，即F
7、ITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。注：首先要知道双阴性细胞的情况，其次是在检测管中，必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。,（3）IgGFITC/PE标记抗体：同理，将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致，前提是必须有PE单阳性细胞和双阴性细胞。（4）当设置好以上补偿条件后，即补偿调节完毕。,（5）进行多色分析时，必须做各荧光间的补偿。方法同上，先准备各种标记的荧光阴性对照，确定合适的电压，并逐一调节各荧光标记抗体，与其他荧光对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。,二、流式细胞术的重要术语,1.前向散射与侧向散射2.Coulter效应与电子体积3.荧光信号及其面积与
8、宽度4.光谱重叠与荧光补偿5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间,1.前向散射与侧向散射,前向散射光(forward scatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关侧向散射光（side scatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关,利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。,散射光的测定,2.Coulter效应与电子体积,Coulter效应原理：微小粒子并不导电，但通过充满电解液的小孔时可产生电阻变化，细胞体积越大，电阻的改变越大。可将电阻变化记录为电位变化，用于微小粒子体积测量和计数上。采用这种方法计算该颗粒的体积就是电子体积。,3.荧光
9、信号及其面积与宽度,荧光信号被光电倍增管收集，形成信号脉冲，每个信号脉冲都有其高度、面积与宽度。每种颜色的荧光占用一个特定的检测器，每种颜色的检测器称为一个荧光通道。脉冲高度表示荧光信号的强度，表示为FLn-Height，n为仪器的荧光收集器序数。脉冲面积（FLn-A）是采用积分计算的荧光通量。（荧光脉冲面积比高度更能准确反映DNA含量，用于DNA倍体分析）脉冲宽度（FLn-W）反映荧光的分布，常用来区分双连体细胞。,4.光谱重叠与荧光补偿,利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”,5.细胞基础荧光域值与阴性对照置信区间,对于流式样本，由于细胞的自发荧
10、光、荧光抗体会与待测标本中的细胞发生少量非特异性结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号，这部分信号称为基础荧光域值。在流式标本检测过程中，通常需要通过调节电压将阴性细胞的基础荧光域值置于95%或99%的置信区间内，作为阴性对照可信区间设定。,一、流式细胞仪基本结构与功能,1.流式细胞仪基本结构2.流式细胞仪的基本功能与应用,2.流式细胞仪的基本功能与应用,定性或定量分析功能细胞膜：细胞表面抗原，表面糖类，表面受体，膜电位，膜结合钙离子，细胞表面电荷等，这对确定细胞的性质及其功能重要。细胞质：各种细胞成分，包括蛋白质、RNA、各种细胞器中的特殊成分、各种抗原、基因编码蛋白、细胞因子等。细胞核：DN
11、A、RNA、蛋白质等分选功能可将具有特定性状或功能的细胞从混合细胞群中分离出来，再进行分析或培养。优点：分选纯度高（可达99%），分选回收率高，可分选活细胞。,1.流式细胞仪基本结构,流动室与液流系统光源与光学系统激发光源光学系统信号收集与光电转换系统计算机与分析系统,流动室与液流系统,PMT,PMT,PMT,PMT,二分镜,带通滤光片,激光,1,2,3,4,Flow cell,由若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，它们分别将不同波长的光信号送入到不同的探测器。滤光片主要分为四类：长通滤光片（LP）、短通滤光片（SP）、带通滤光片（BP）和二分镜,光学系统,激发光源,激光(Laser)是
12、一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长:台式机为固定波长488nm,633nm，大型机波长谱线宽包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647 nm,信号收集与光电转换系统,主要由光电转换器件、放大器和信号处理电路组成光电转换器件主要功能是将光信号转换成电流信号。由光电二极管和光电倍增管（PMT）来执行。放大器分两类：线性放大和对数放大。信号处理系统的主要功能是将电信号转变成脉冲信号、数字信号最终传送给计算机系统进行处理。,计算机与分析系统,计算机系统用于控制整个仪器的运行，数据采集和数据分析。各公司所产的流式细胞仪都有
13、自己特有的分析系统。,第二节 流式细胞术的数据分析,一、参数前向散射光FSC:反映颗粒的大小侧向散射光SSC:细胞内部结构复杂程度荧光FL:细胞被染上荧光部分数量的多少二、数据的显示与分析三、设门,二、数据的显示与分析,1.单参数直方图2.二维散点图3.二维等高线图4.假三维图5.三维图,以分布直方图(distribution histogram)来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。,1.单参数直方图,看图技巧：1.先看横、纵坐标，了解检测目的；2.看图形分布，直方图峰形越往右移，代表其荧光强度越强；3.M1的
14、确定是根据阴性对照细胞的基础荧光域值设定的，峰形右移，荧光信号大于基础荧光域值（M1），表示阳性（M2）；4.数据统计时，检测目的物一般用各Marker区内的细胞所占百分比或用平均荧光强度表示；5.几个直方图的比较，关键看Marker（M1、M2）的位置以及细胞数。,能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横、纵坐标分别代表两个独立参数，平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。,2.二维散点图,看图技巧：1.先看x，y轴，了解代表参数的意义；2.再看其四个象限，并了解各象限意义；3.比较几个散点图时，关键看四象限划分区间的位置以及各象限散点的密度；4.数据统计时，检测目的物一般用各象限区内
15、的细胞数占门内细胞百分比或用平均荧光强度表示。,用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。,3.二维等高线图,纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。,4.假三维图,5.三维图,任意选三个参数为x，y，z轴，构成一个三维图，每一群细胞根据各自参数处于一个相对独立的空间，三维图对比较复杂的亚群的显示更为直观明了。,三、设门,流式细胞术数据分析的目的是通过与适当的阴性对照进行比较，来确定所分析样本中表达标记物的细胞百分率。完成这一过程的第一步就是需要确定我们所要研究的目的细胞群，其术语为设门（gating）。设门是指在细胞分布图中指定某一个范围或某一
16、细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。根据散射光设门根据某一细胞性状设门组合设门,一、样品制备：单细胞悬液 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、质量控制,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求,一、样品制备,流式细胞仪的样品要求：单细胞悬液，避免任何细胞沉积 被检细胞或颗粒大小0.240um 样品中至少20000个细胞，浓度105-106个/毫升,（一）外周血淋巴细胞样品的制备,利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散点图,单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成
17、单细胞悬液。,（二)培养细胞的样品制备,机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。表面活性剂处理法：Triton-100、皂素等。,(三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备,机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等，也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光染色处理不受影响。,防止细胞自溶，保持细胞膜原
18、有的特性保存的方法：1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。,(四）单细胞悬液的保存,染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料,荧光染料 激发波长（nm)发射波长（nm)颜色,FITC 488 525 深蓝色PE(RDI)488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色,二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染
19、色,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光染料产生的荧光信号。,PE,CY5,CY5,488nm,能量传递染料：,荧光染料与细胞成分的结合方式：结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式1、直接免疫荧光染色2、间接免疫荧光染色,（二）免疫荧光标记,3、双或多参数荧光抗体的组合标记,FITC+PE 488 525、575 绿色、橙色FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色FITC+PeCy5 488 525、675 绿色、红色FITC+ECD 488 525、625 绿色、橙红色F+P+Pe
20、Cy5 488 525、575、675 绿、橙、红色F+ECD+PeCy5 488 525、575、675 绿、橙红色、红色F+P+APC 488 525、575 绿色、橙色 633 670 红色,荧光染料 激发波长（nm)发射波长（nm)颜色,（一）单细胞悬液制备的质量控制（二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响（三）仪器操作技术的质量控制,三、质量控制,1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为同型对照（阴性对照）2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控，使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。,（四）免疫检测的质量控制,第四节 流式细胞术的应用,细胞表面分子的检测与分析细胞内或细胞核内抗原检测与分析细胞凋亡的检测与分析DNA含量检测与细胞周期的分析细胞增殖的检测与分析细胞分选细胞毒的检测与分析可溶性蛋白质分子的检测与分析报告基因的检测与分析,
