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1、发酵工程无菌技术：纯培养发酵技术：发酵全过程只有生产菌，无杂菌,第五章 灭菌及无菌空气制备,在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的不良后果：杂菌污染使基质或产物被杂菌消耗，造成生产能力下降；杂菌产生的某些代谢产物，改变了培养液的理化性质，使提取精制发生困难；杂菌可能会降解目的产物，使得生产过程失败；杂菌会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象，使生产失败,为了保证培养过程的正常进行，在接种要培养的微生物之前，需要进行灭菌与消毒。灭菌对象：培养基；设备与管道；空气系统；流加料、消泡剂；必要时还有对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体,工业上具体措施包括：1）使用的培养基和设备须经灭菌；2
2、）好氧培养中使用的空气应经除菌处理3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的种子。,消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死物料、容器器具内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60，30min）。灭菌(sterilization)：用物理或化学方法杀死或除去物料、空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。,常用消毒、灭菌原理与方法,化学药剂消毒：甲醛或新洁尔灭、高锰酸钾等 使蛋白质凝固变
3、性、酶失活；破坏细胞膜；物理方法辐射灭菌：紫外线、X射线，高能辐射与菌体核酸光化学反应干热灭菌法：氧化作用、高温使蛋白质变性和电解质浓缩中毒湿热灭菌法（最常用）：蒸汽热使蛋白质变性，大分子氢键收到破坏；过滤介质除菌：微生物不能透过滤膜而除菌,湿热灭菌法,蒸汽具有强的热穿透力，灭菌易于彻底，效果最好，应用饱和蒸汽进行灭菌最为普遍。适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌,例如：实验室内的高压蒸汽灭菌、发酵车间采用的设备空消和培养基实消。,过滤介质除菌法,过滤介质除菌采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过滤，去除微生物的方法。液体：0.22m或0.45m滤膜气体：纤维介质滤材捕捉极微小的悬
4、浮微生物适用范围：对压缩空气制备无菌空气；酶溶液、啤酒及其他不耐热化合物溶液除菌。,高压蒸汽灭菌利用饱和蒸汽的高温杀死微生物的同时，高温还可能造成培养基成分的损失。培养基灭菌的要求：达到要求的无菌程度尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解合理选择灭菌条件的关键：了解灭菌温度、时间对微生物死亡和培养基成分破坏的关系。,第一节 培养基和发酵设备的灭菌,致死温度：杀死微生物的极限（最低）温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间
5、愈短。,用湿热灭菌方法对培养基灭菌时，加热的温度和时间对微生物死亡和营养成分均有破坏作用，因而选择一种既能达到灭菌要求又能减少营养成分被破坏的温度和受热时间，是研究培养基灭菌质量的重要内容。培养基的营养成分的破坏和菌体死亡都符合Arrhenius Equation方程:,一、培养基的灭菌温度选择,反应速度常数增加的倍数,K值为比死亡速率,反应速率常数,k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。T相同，k值越小，则微生物越是耐热。同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小，温度越高，k值增大。,121某些细菌芽孢的k值,随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍
6、数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。达到相同灭菌效果时，温度T越高，K值越大（比死亡速率常数），所需灭菌的时间t 越短。在实际生产中为了既达到灭菌目的又较好地保存营养成分，最好采用较高的温度，较短时间进行灭菌，瞬时高温灭菌UHT。即可达到杀死培养基中的全部微生物的目的，又可减少营养成分的破坏。通常情况选择灭菌温度为121，当培养基中含热敏成分，则降低温度,在确定了培养基灭菌的温度后，如何来计算灭菌时间？,t:发酵培养基的灭菌时间k:比死亡速率，min-1,不同微生物在某一温度下的k值差异N0:开始灭菌时培养基物料中的活菌数，污染程度Nt:培养基经灭菌时间t后中的残留活菌数（灭菌程度一般为
7、0.001，即1000次有一次失败），灭菌程度,在计算灭菌时间过程中需考虑两个问题：一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据；二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中有一次失败。,1培养基 pH值：培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的pH值越低，所需杀灭微生物的温度越低。时最难灭菌。,pH值对灭菌时间的影响,二、影响培养基灭菌的其它因素,除了灭菌温度和时间外，影响灭菌效果的因素还有：,2、培养基成分：油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物耐热性；大肠杆菌E.coli在水中加热60-65死亡；在10%糖溶液中，需要70加热46min，在30%
8、糖溶液中，需要加热30min。另一些物质，如高浓度的盐类、色素等的存在等可削弱其耐热性3、泡沫：对灭菌极为不利，泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透。在易产生泡沫的培养基中加入消泡剂。,影响灭菌效果的因素,4、培养基中微生物数量,微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长。,培养基中微生物孢子在105 灭菌所需时间,在实际生产中，不宜采用严重霉变的原料和腐败的水质。,影响灭菌效果的因素,5、培养基的物理状态 固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于1mm的颗粒培养基，不必考虑颗粒对灭菌的影响，但含有少量大颗粒和粗纤维的培养基的灭菌，则
9、要适当提高温度，在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌不彻底。,6.其他：微生物细胞的含水量、菌龄、搅拌和空气排除情况等会影响培养基的灭菌效果。,三、发酵培养基灭菌工艺,1、分批灭菌（实罐灭菌，实消）2、连续灭菌（连消）3、固体灭菌,（一）分批灭菌,分批灭菌也叫间歇灭菌或实罐灭菌、实消。培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称为实罐灭菌，或实消。优点：无需其他附属设备，操作简便；缺点：加热和冷却时间长，营养成分有一定损失，不能采用高温快速灭菌一般采用121,分批灭菌的时间计算,若
10、不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间。,例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121下进行实罐灭菌。原污染程度为每毫升2105感染耐热细菌芽孢，121时灭菌速率常数为1.8min-1，求灭菌失败概率为0.001时所需要的灭菌时间。,解：N0=40 106 2105（个）Nt=0.001（个）k=1.8min-1,240,160,120,80,时间（min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,分批灭菌过程包括：升温、保温和冷却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。应当避免长时间的升温加热阶段，因为加热时间过长，不
11、仅破坏营养物质，而且也有可能引起培养液中某些有害物质的生成，从而影响培养过程的顺利进行。,分批灭菌温度变化曲线,分批灭菌的工艺操作,操作过程：1、空罐准备：清洗、检修和检测2、升温：把培养基加热到灭菌所需的温度，夹套和直接通蒸汽加热3、保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间4、冷却保压：把培养基降低到接种的温度,三路进汽：蒸汽直接从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。,四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气,分批灭菌设备示意图,思考：灭菌过程培养基的体积和成份变化，对发酵过程有何影响？,优点：不需要专门的设备，投资少，对
12、设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，而且灭菌效果可靠。,连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地被冷却；因此可在比分批灭菌更高的温度下进行灭菌；而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短，极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。,（二）连续灭菌,1、连续灭菌的温度变化 培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。,连续灭菌时间的计算：,连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。,例：发酵罐内装40m3培养基，在温度131下进行连续灭菌。原污染程度为每毫升2105感染耐热细菌芽孢，131时灭菌速率常数为15mi
13、n-1，求所需要的灭菌时间。,解：c0=2105（个/ml）ct=1/40 106 103=2.5 10-11（个/ml）k=15min-1,连续灭菌的工艺流程,配料预热罐：预热到6070，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声音。,连消塔：使高温蒸汽与料液迅速解除混合，使料液温度很快上升到灭菌温度（126132）,维持罐：使料液在灭菌温度下保持57min，以达到灭菌目的；,冷却管：生产上一般采用冷水喷淋冷却到4050后，输送到灭菌的罐内,分批灭菌和连续灭菌的比较,设备灭菌，又称空消(Stearilization of fermenter)实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌（
14、实消）培养基采用连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌加入前进行空消，通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。管道、空气过滤器、补料罐、计量贮存罐,发酵附属设备灭菌,四、培养基和设备、管路灭菌的条件,1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147Mpa。维持45min，灭菌过程从有关阀门排出空气，并使争取通过达到死角灭菌；灭菌结束，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098Mpa。,2、空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器
15、中空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从下、下排气口排气，维持压力0.147Mpa，灭菌2h，灭菌完毕通入压缩空气吹干。,3、种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时，关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121，维持30min，谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110，维持10min。,4、发酵培养基实罐灭菌 从夹层或盘管通入，蒸汽间接加热至90，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时，关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121，维持30min，谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为105，维持5min。,5、.发酵培养基连续灭菌 一般培养基为130，
16、维持5min，谷氨酸发酵培养基为115，68min。,第二节 空气除菌,城市上空空气中含有的细菌数为3000-10000个/m3，因此在空气引进发酵罐之前必须进行严格处理，除去其中含有的微生物和其他有害成分。抗生素、氨基酸和酶制剂等多数品种发酵，耗氧量大，无菌程度要求十分严格.一、通风发酵对无菌空气的要求1.空气中微生物的分布 空气中含菌量随环境的不同而有很大的差异。2.发酵对空气无菌程度的要求 一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1次失败。,空气除菌设备空气过滤除菌的目的Ns10-3个/m3，同时使空气有一定压力空气过滤除菌流程普通空气冷却除菌流程高效前置
17、过滤除菌流程,高效前置过滤除菌流程,空气预处理流程,空气除菌总流程如下：高空采风 粗滤器 空压机 贮罐冷却器 油水分离器 丝网分离器加热器 总过滤器 分过滤器 发酵罐,空气除菌方法,加热灭菌（220C，20秒）灭菌彻底，能耗大，成本高静电除菌除菌效果差，仅用于初除菌辐射灭菌254-265nm效果最佳，仅限表面灭菌介质过滤除菌主流的除菌方式,空气压缩机余热灭菌图,过滤除菌(Filter sterilization)及其控制,按除菌机制可分为：1 绝对（表面）过滤 2 深层介质过滤,1 绝对（表面）过滤 定义：滤空在表面；依靠直接拦截捕获颗粒。特点：易于控制过滤后的空气质量，节约能量和时间，但孔隙
18、小于0.5m，材料较贵，容量有限。常用滤膜,2、深层介质过滤除菌,定义：1、污染物被介质内部结构捕获的一种过滤介质，滤孔贯穿于整个介质厚度。2、调整流道可以获得高容污能力,是以棉花、玻璃纤维、尼龙等纤维或活性炭作为介质填充成一定厚度的过滤层，或将超细玻璃纤维、聚乙烯醇、聚四氟乙烯、金属烧结材料制成过滤层，其介质的空隙大于被滤除的尘埃或微生物。空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。特点：设备及操作费用低廉，适用于大量空气的处理。,2空气除菌设备 以纤维状物或颗粒状物为介质空气过滤器 所构成的过滤器 以微孔滤纸、
19、滤板、滤棒构成 的过滤器(1)纤维状或颗粒介质过滤器 过滤层厚度大，体积大，压力降大，操作麻烦，装填介质费时费力。(2)过滤纸类过滤器 除菌效率相当高，对0.3m以上颗粒的过滤效率达99.99%以上，阻力小，压力降小，但强度不大，尤其是受潮后强度更差。,一般用于总过滤器,一般用于分过滤器,发酵罐空气过滤器,简答：影响灭菌的因素有哪些？,问题1,灭菌温度和时间,培养基的物理状态,培养基的pH值,培养基中的微生物数量,微生物细胞中水含量,微生物细胞菌龄,微生物的耐热性,空气排除情况,搅拌,泡沫,为什么说培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，灭菌温度就得相应高些？,问题2,为什么说液体培养基比固体培养基更易灭菌？,问题3,培养基的pH值越低，灭菌所需的时间就愈短（）,问题4判断,在实际生产中，不宜采用严重霉腐的腐败的水质，是因为其微生物数量多，影响灭菌效果。（）,微生物含水量越多，灭菌时间就得越长。（）,发酵罐的基本结构,机械搅拌通风发酵罐,发酵罐的搅拌器功能：打碎空气（径向），使发酵液充分混合（轴向）类型：平叶式、弯叶式、剑叶式叶片数量：一般6片，最少3片，最多6片,机械消泡方法罐内消泡：在发酵罐内消除泡沫耙式消泡桨、碟式消泡器等罐外消泡：将泡沫引出发酵罐外，消泡后再 返回罐内旋转叶片消泡器、离心式消泡器等,
