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1、制作：李志红董彩虹肖方祥盛德乔,生物化学教学课件,绪 论,Anything more than an extremely superficial comprehension of life demands a knowledge of biochemistry.,生物化学(Biochemistry)：生命的化学,在分子水平探讨生命的本质。研究对象：生物。生物化学的主要任务是阐述活细胞内及细胞间的化学反应及其与生命活动的关系。主要内容:1、研究生物分子的结构及功能。生物大分子是由某些基本单位按一定顺序和方式连接所形成的多聚体（polymer），M一般大于104。包括蛋白质、核酸、脂类及糖等。2、
2、新陈代谢及其调节。3、遗传信息的贮存、传递、表达及调控（分子生物学）。,人类基因组计划（human genome project）：美国Renato Dulbecco在1985年提出,美国政府1990年10 月正式启动,耗资30 亿美元，旨在画出一张人体地图,找到46 条染色体上30 亿个碱基对约10 万个基因的准确位置，破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自己。是生命科学领域有史以来最宠大的全球性研究计划，“生命登月计划”。2000年6 月26日,克林顿亲自在白宫发表了人类基因密码组合草图。后基因组计划将进一步深入研究各种基因的功能与调节。拿着基因组图谱去看病；10年内基因
3、检测会成为例行手段；基因疗法会成为常规疗法。基因产业、基因资源脑黄金、脑白金基因营养：核酸营养,中国近代生物化学的发展吴宪与汪猷、张昌颍等人一起完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。1965年，我国首次人工合成了结晶牛胰岛素。1981年又成功合成了酵母丙氨酰tRNA。本世纪末我国参与了人类基因组计划。,生物化学与临床医学1、All disease has a biochemical basis.2、Biochemical studies contribute to diagnosis,prognosis and treatment.3、
4、Many biochemistry studies illuminate disease mechanisms and disease inspire research in specific area of biochemistry。,总目录,第一篇 生物大分子的结构与功能第二篇 物质代谢及其调节第三篇 基因信息的传递第四篇 专题篇,第一编 生物大分子结构与功能,第一章 蛋白质的结构与功能第二章 核酸的结构与功能第三章 酶,第一章 蛋白质的结构与功能,第一节 氨基酸与多肽第二节 蛋白质的分子结构第三节 蛋白质结构与功能的关系第四节 蛋白质的理化性质及分离纯化,蛋白质的元素组成,C 5055%
5、H 67%O 1924%N 1319%S 04%有些蛋白质还含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各种蛋白质含氮量接近，平均为16%。1克氮相当于6.25克蛋白质为测定样品中蛋白质含量的依据。,第一节 氨基酸与多肽,一、氨基酸及其分类组成蛋白质的20种氨基酸均为L-氨基酸,20种氨基酸按侧链R的理化性质分为4类：,1、非极性疏水性氨基酸,2、极性中性氨基酸,3、酸性氨基酸,4、碱性氨基酸,人体必需氨基酸有八种：Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr“假 设 来 借 一 两 本 书”脯氨酸为亚氨基酸。,半胱氨酸（Cys）常以胱氨酸的形式存在,二、肽键与肽链,寡肽(oli
6、go peptide)多肽(poly peptide)氨基酸残基(reside):主链、侧链氨基末端(amino terminal)或N末端羧基末端（carboxyl terminal）或C末端,三、重要的多肽,1、谷胱甘肽（Glutathione，-GSH）谷氨酰半胱氨酰甘氨酸,GSH具有重要的功能：,1、解毒功能：与重金属离子、环氧化物（致癌物）结合排出体外。2、维持红细胞膜的完整性。3、参与高铁血红蛋白的还原作用。4、促进铁的吸收。,2、多肽类激素：促甲状腺素释放激素。3、多肽类抗生素：短杆菌肽4、酪蛋白磷肽（促进钙吸收剂 CPP）CPP分子中具有丝氨酸磷酸化结构，肠道内有钙能与CPP上
7、的磷结合使之成为可溶性钙，利于小肠对其吸收。,蛋白质的分类,按组成分类:单纯蛋白质:如血清清蛋白结合蛋白质:核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白、色蛋白。按溶解度分类：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、硬蛋白、组蛋白、精蛋白。按分子形状分类：纤维状蛋白质：分子构象呈纤维形，长/短轴之比大于10，多为结构 蛋白，难溶于水。球状蛋白质：近似球形或椭圆形，多数可溶于水或盐溶液。,第二节 蛋白质的分子结构,一、蛋白质分子中的非共价键。1、氢键 如水分子,2、疏水键,3、离子键另外还有二硫键。,二、蛋白质的一级结构（Primary Structure）,蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。
8、1954年英国生化学家Sanger报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。Sanger由此1958年获Nobel 化学奖。1965年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。蛋白质的一级结构由遗传信息决定，其一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。,蛋白质一级结构测定的意义许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白亚基6 位Glu被Val代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。若亚基6位Glu被Lys取代引起另一类贫血：血红蛋白C病。比较不同生物细
9、胞色素C的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素C的一级结构越相似。,三、蛋白质的二级结构（secondary structure）,二级结构：多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。为主链构象，不涉及侧链构象。,肽单元（peptide unit）或肽键平面：1925年L.Pauling和等用X线衍射分析肽键的CN键长时发现其键长为0.132nm,不同于CN单键键长0.149nm,也不同于C=N双键键长0.127nm.介于二者之间,故其有一定程度的双键性能,C与N不能以CN为轴心自由旋转。参与肽键的6 个原子C1、C、O、N、H、C2 被约束于一个
10、平面上，称为肽键平面，为形成二级结构的基础。,蛋白质螺旋结构(-helix),Pauling and Corey提出。右手螺旋(顺时针)。肽链的主链形成紧密的螺旋,侧链伸向外侧，每一圈包含3.6个氨基酸残基,每个残基跨距为0.15nm,螺旋上升一圈的距离(螺距)为3.60.15=0.54nm.螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽键的NH和第四个肽键的CO形成氢键,第n个肽键的NH和第n+3个肽键的CO形成氢键。,螺旋结构形成的限制因素:,凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不可能形成氢键。静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻,则因pH=7.0时都带负电荷,防碍
11、螺旋的形成;同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内,正电荷相斥,也防碍螺旋的形成。位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍螺旋的形成。,折叠（-pleated sheet）,平行式,N端,N端,反平行式,N端,C端,折叠靠不同肽键之间的肽键上CO与NH形成氢键而得以稳定。反平行式比平行式稳定。,转角（-turn）：折叠反平行式的转折处。第一个残基的C=O与第四个残基的NH形成氢键。无规卷曲（random coil）：没有确定的规律性。,模序（motif）：蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成 一个有特殊功能的空间结构。如钙结合蛋白中的结合钙离子的模序和锌指结构。,钙结合蛋
12、白中的结合钙离子的模序,蛋白质空间构象的正确形成除一级结构为决定因素外，还需要一类称为分子伴侣（chaperon）的蛋白质参加。分子伴侣可防止错误的聚集发生，使肽链正确的折叠；也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。分子伴侣对二硫键的形成起重要作用。,蛋白质的三级结构（teritary stucture）,三级结构:整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,即整条肽链的三维构象。结构域:在蛋白质结构中形成一紧密的结构,具有特殊的功能,多为蛋白质的活性部位。有的蛋白质分子有一个结构域,有的有多个，如纤连蛋白含有6 个结构域。维持蛋白质三级结构的主要作用力为侧链间的相互作用:氢键、离
13、子键、疏水键及二硫键。,蛋白质的四级结构（quaternary structure）,四级结构：各亚基的空间排布。亚基（subunit）：有的蛋白质分子由两条以上的肽链通过非共价键相连聚合而成，每条多肽链称为一个亚基。维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。,第三节 蛋白质结构与功能的关系,一、一级结构是空间构象的基础 蛋白质的一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。Anfinsen在研究核糖核酸酶时发现。,天然状态,无活性,天然状态,_,二、蛋白质空间结构与功能的关系肌红蛋白（M
14、yoglobin）Mb存在于肌肉中，心肌含量特别丰富。是分子量为16700的小分子球状蛋白质，由153个氨基酸残基及一个血红素组成。五十年代，英国科学家John Kendrew和Perutz 用X衍射对抹香鲸肌红蛋白的三级结构研究获得成功，是第一个获得完整构象的蛋白质。它有8段螺旋结构,A、B、C、D、E、F、G、H。整条肽链折叠成紧密球状分子，疏水侧链大都在分子内部，极性带电荷的则在分子表面，因此水溶性好。1962年Kendrew和Perutz 由于测定了肌红蛋白及血红蛋白的高级结构而获Nobel化学奖。,Mb分子内部有一个口袋形空穴，血红素居于其中。血红素是血红蛋白及细胞色素等的辅基,具有
15、重要的生理功能。血红素是含铁的卟啉化合物，卟啉由四个吡咯环组成，铁原子位于卟啉环的中央，Fe2+有6个配位键，其中4 个和吡咯环的N配位结合，1个与Mb93位（F8）His结合，氧与Fe2+形成第6 个配位键，接近64位E7His。,分子中有一口袋形空穴,血红素居于此空穴中,铁卟啉上的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中两个碱性氨基酸侧链上有正电荷相连,肽键中的His又与Fe2+形成配位结合,故血红素在此空穴中保持稳定.,血红素平面,二、血红蛋白(Hemoglobin),血红蛋白（Hb）由四个亚基(珠蛋白和血红素)组成。成人红细胞中主要为HbA1(22),其中链141aa,链146aa,各带有一个
16、血红素与O2结合所以一分子Hb能与4分子O2结合。不同发育阶段链相同,链不同，胎儿期为，胚胎期为。Mb与Hb的氧饱和曲线 Hb氧饱和曲线为S形,Mb为直角双曲线。,说明Mb对氧有很强的亲和力，在体内毛细血管中氧分压大于4KPa(30mmHg),组织中Mb几乎全与O2结合而达到饱和,只有细胞内氧耗很大而使PO2下降到很低时,Mb才释放其中的氧,故组织中的肌红蛋白是很好的储氧物质。,Mb 的P50=0.13KPa(1mmHg),Hb:Hb与O2结合的S型曲线提示其4 个亚基与4 个O2结合时平衡常数不同。,K1 K2=K3 K4,协同效应:一个亚基与其配体结合后,能影响此寡聚体中一亚基与配体的结合
17、能力。正协同效应、负协同效应.,Perutz等利用X线衍射分析了Hb和氧合Hb的三维结构图谱，解释了正协同效应。未结合O2时，Hb结构紧密，称为紧张态（T态），T态Hb与O2亲和力小；结合O2 后，结构变得相对松弛，称为松弛态（R态）。变构效应（allosteric effect）：一个蛋白质与它的配体或其它蛋白质结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能需要。小分子O2称为变构剂。,Bohr效应：1904年Christian Bohr发现Hb与O2的结合也受CO2及pH影响。PCO2升高时，Hb与O2的结合降低，酸性溶液中Hb与O2的亲合力也降低，氧解离曲线右移。故PCO2升高实际上是p
18、H下降影响Hb。pH降低，即溶液中H+浓度升高，使-NH2及咪唑基等质子化，有利于盐键的形成，使Hb结构趋向紧密，从而降低Hb与O2亲和力，Mb没有四级结构也就没有Bohr效应。Bohr效应使Hb运输O2效率更为提高。肺部呼出CO2，PCO2下降，Hb与O2亲和力加强，利于结合更多氧输入体内。当血液流经组织时，CO2自组织进入血液，PCO2升高，pH下降，Hb与O2亲和力减弱，有利于O2释放入组织。,第三节 纤维状蛋白质,纤维状蛋白质都是由几条肽链绞合而成，难溶于水，如胶原蛋白、毛发中的角蛋白、弹性蛋白。主要功能是提供坚实的支架，连接各细胞、组织、器官。一、胶原蛋白（Collagen）组织中胶
19、原蛋白及弹性蛋白含量（占蛋白质总量百分比）,氨基酸组成特点:Gly占1/3,脯氨酸和羟脯氨酸占1/5以上,Tyr含量少,Trp、Cys缺乏，为营养不完全氨基酸。氨基酸序列及分型：胶原蛋白微温酸溶液超速离心后可得3 个组分.组分是胶原蛋白分子中多肽链的基本单位.2个 组分交联成二聚体即为组分,3聚体为组分,组分又有数种 链,其氨基酸组成不同,但肽链长度近于相同,1、2 等。原胶原（Tropocollogen）：3条 链绞合一起，3条 链可以相同，也可以不同。不同类有胶原由于其 链的氨基酸组成及含糖量不同而性能不同。胶原蛋白分子中（GlyProY）200（GlyXHyp）200胶原纤维：电镜下可见
20、原胶原有规律地排列成原纤维。如型原胶原由三条长肽链相互盘绕成右手螺旋,每条长肽链本身为左手螺旋.其稳定与其一级结构密切相关.原胶原的链一级结构中96%属(GlyXY）n，其中，X常为Pro，Y常为Hyp，在三链超螺旋中，Gly残基在超螺旋内侧，Gly侧链为H，故三链排列紧密。,除了有Van der waals 之外，GlyNH和邻近链CO形成氢键，有赖于大量无侧链的Gly存在于内侧，才能形成紧密的构象。胶原蛋白合成后还受到一系列修饰。如脯氨酸及赖氨酸羟化为羟脯氨酸和羟赖氨酸，羟化反应以维生素C为辅因子；赖 氨酸残基的氨基在赖氨酰氧化酶的催化下,可氧化成醛基,此醛基可与邻近的赖氨酸氨基或羟赖氨酸
21、的羟基缩合,形成共价键稳定原纤维的结构.因为羟化酶需要VC,故VC缺乏时此类稳定 结构的共价键不能形成,以致发生牙龈出血,创伤不易愈合等病变.,二、弹性蛋白分布：富有弹性的组织，如肺、大动脉等。初合成时为水溶性单体称为原弹性蛋白。原弹性蛋白从细胞分泌出来后，Lys的NH2受赖氨酰氧化酶催化而氧化脱氨生成醛基.3个Lys衍生的醛基与1 个Lys的NH2缩合形成十字架样的特殊交联,使弹性蛋白卷曲而具有弹性.交联后极稳定,极难溶解.三、角蛋白毛发、指甲、羽毛为角蛋白。哺乳动物角蛋白为-角蛋白、鸟类及爬行类为-角蛋白。-角蛋白富含半胱氨酸,并与邻近的多肽链交联,形成二硫键,因此-角蛋白很难溶解,也经受
22、得起一定的拉力。毛料衣服易被蛀掉是由于一类蛾的幼虫消化液中有大量巯基化合物，使二硫键还原成巯基，肽链之间的聚合被解除，肽链被消化。蚕丝蛋白是折叠富含Gly、Ala、Ser。牢固但不能拉伸。,第四节 球状蛋白质,一、肌红蛋白（Myoglobin）Mb存在于肌肉中，心肌含量特别丰富。是分子量为16700的小分子球状蛋白质，由153个氨基酸残基及一个血红素组成。血红素是血红蛋白及细胞色素等的辅基,具有重要的生理功能.血红素是含铁的卟啉化合物，卟啉由四个吡咯环组成，铁原子位于卟啉环的中央.Fe2+有6个配位键，其中4 个和吡咯环的N配位结合，1个与Mb93位（F8）His结合，氧与Fe2+形成第6 个
23、配位键，接近64位E7His。五十年代，John Kendrew 用X衍射对抹香鲸肌红蛋白的三级结构研究获得成功，是第一个获得完整构象的蛋白质。它有8段螺旋结构,A、B、C、D、E、F、G、H。整条肽链折叠成紧密球状分子，疏水侧链大都在分子内部，极性带电荷的则在分子表面，因此水溶性好。,第四节 蛋白质的理化性质 及分离纯化,一、蛋白质的理化性质1、两性电离及等电点,等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。,酸性氨基酸pI7,碱性氨基酸pI 7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性Aa较多,其pI偏碱;如从雄性鱼类
24、精子中提取的鱼精蛋白含Arg多,其pI 约为12,若含酸性Aa较多,则pI偏酸。蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。蛋白质等电点性质为电泳分离的依据.,2、胶体性质蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀,3、蛋白质变性（denaturation）在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的非共价键断裂，天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧失。蛋白质变性后一级结构没有发生变化。
25、只是空间构象发生变化。蛋白质变性后其溶解度降低，粘度增加，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。变性蛋白质不一定都沉降，沉降出的蛋白质也不一定变性。造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、X线等。复性：有的蛋白质变性后，将变性剂除掉，能恢复活性。,4、蛋白质的紫外吸收Trp、Tyr280nm处有特征吸收峰，可作蛋白质定量测定5、蛋白质的呈色反应（1）茚三酮反应（ninhydrin reaction）。（2）双缩脲反应（biuret reaction）。肽键与双缩脲试剂反应呈紫色。氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离纯化1、盐析及丙酮 沉淀盐析：大量
26、中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀.各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同.,血清,2、电泳 3、透析：根据分子量的大小，用透析袋将大、小分子物质分开。4、层析：离子交换层析、亲和层析等5、分子筛：又称凝胶过滤层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖。6、超速离心S：单位离心场的沉降速度。1S=110-13秒,三、多肽链中Aa顺序分析,1、组成分析：蛋白质盐酸水解后成为个别Aa，用离子交换树脂将各种Aa分开，测其量并算出各Aa在蛋白质中的百分组成或个数。2、N、C端标记N端：二硝基氟苯或甲氨基萘磺酰氯 C端：羧肽酶,DNP-A
27、a 黄色,3、水解 胰蛋白酶：Lys或Arg羧基形成的肽键 胰凝乳蛋白酶：芳香族Aa羧基侧的肽键 溴化腈：Met羧基侧的肽键4、测序；Edman降解法,PITC,苯氨基硫甲酰Aa（PTC-Aa）,苯硫乙内酰脲（PTHAa）,pH=8.3,无水HF,习题,1、PI为6.5的蛋白质A、在pH7的溶液中带正电 B、在pH7的溶液中带负电C、在pH5的溶液中带负电 D、在pH5的溶液中为兼性离子2、多肽链中主链骨架的组成是A、NHCCOCNH B、CNHCCOCNHC、CCONHCCONH D、CCHNOCCHNO E、CCNHOCCN3、下列蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，最先被洗脱的是：A、马肝过氧化
28、氢酶（Mr：247500）B、Mb（Mr：68500）C、血清清蛋白（Mr：68500）D、牛乳球蛋白(Mr:35000)E、牛胰 岛素（Mr：5700）,4、下列哪些因素可促进Hb转变为HbO2A、氧分压增高 B、血液pH下降 C、CO2分压增高D、血液H+增高 E、温度增高5、有一含a、b、c、d四种蛋白质混合液，它们的分子量相同，pI为5，8.6,6.8,和9.2.在pH为8.6的缓冲液中,用醋酸纤维素薄膜电泳时,四种蛋白质电泳区带的排列次序(从正极开始)是:A、a、c、b、d B、a、b、c、dC、d、b、c、a D、c、b、a、dE、b、c、d、a,6、具有四极结构的蛋白质分子，在一级结构分析时发现A、只有一个N端和一个C端 B、具有一个以上N端和C端C、没有N端和C端 D、一定有二硫键存在7、蛋白质分子中不存在的氨基酸是A、半胱氨酸 B、胱氨酸 C、瓜氨酸 D、精氨酸 E、羟脯氨酸答案：1、B 2、C 3、A 4、A 5、A 6、B 7、C,习 题某溶液中蛋白质的百分含量为55%，此溶液的蛋白质氮的百分浓度为A、8.8%B、8.0%C、8.4%D、9.2%E、9.6%,习 题,名词解释肽单元 模序 蛋白质变性分子伴侣 结构域 变构效应问答1、叙述蛋白质二级结构的要点。2、举例说明蛋白质一级结构、空间构象与功能之间的关系。,
