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1、1,真菌感染的实验诊断,天津医科大学总医院胡志东E-mail,2,真菌感染的危险因素：,中心静脉插管尿道插管广谱抗生素气管插管腹部外科肠胃外营养营养不良住院时间,感染之前定殖,3,医学重要的酵母菌分类Segal B,Bow EJ,Menichetti F:Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-64,条件致病的酵母菌,念珠菌属,非念珠菌属,白念珠菌,非白念珠菌,热带念珠菌近平滑念珠菌光滑念珠菌克柔念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌,隐球菌属新型隐球菌,毛孢子菌属 白吉利毛孢子菌头状毛孢子菌,酵母属 酿酒酵母,红酵母属,4,霉菌,曲霉菌属,非曲霉菌属,烟曲霉,非烟曲霉,黄曲
2、霉黑曲霉土曲霉,镰刀霉茄病镰刀霉尖孢镰刀霉,赛多孢属尖端赛多孢多育赛多孢,接合菌根霉属毛霉属根毛霉属梨头霉属小克银汉霉属,暗色孢霉链格孢霉属万氏霉属双极菌属弯孢属,医学重要的霉菌分类Segal B,Bow EJ,Menichetti F:Infect Dis Clin N Am 2002;16:935-64,5,诊断方法,影像学组织病理学/细胞学培养血清学分子生物学方法：Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）,传统的方法,6,Time Axis of Methods for Detection of Pulmona
3、ry Aspergillosis,Kami M et al,Clin Infect Dis 2001;33:1504-12,7,真菌病实验室诊断主要内容,准确、快速检出真菌病原体真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学,8,真菌感染的诊断,直接涂片真菌培养组织病理真菌培养是“金标准”,9,有意义的真菌培养标本,非经口痰标本非插管尿标本血液或其他无菌体液(胆汁、胸腹水、脑脊液）,10,直接镜检的浮载液和染色剂,KOH-1020%-皮肤标本Gram stain-真菌均为阳性Calcofluor white-荧光染色India-ink-墨汁染色LPCB-乳酸酚棉蓝Immunofluore
4、scence-免疫荧光,11,直接镜检,对痰、窦道排泄物及气管冲洗液等标本直接镜检可以看到透明分支的菌丝、脓血或痰太粘稠用10KOH处理后再进行镜检如果曲霉菌寄生与空气相通的器官中，镜检甚至可以看到曲霉头菌丝有隔，呈二叉型，45 分枝。,12,菌丝和孢子,13,直接镜检酵母细胞,14,隐球菌病直接镜检（墨汁染色）,15,有意义的涂片结果,机体内部标本如血液、腹水、CSF、脓肿穿刺液等新鲜尿液见到大量菌丝及孢子口腔、阴道、支气管灌洗液见到酵母样菌应作培养确定,16,多细胞真菌形 态,17,真菌培养,18,真菌培养检查,目的提高病原体检出的阳性率，确定致病菌的种类。意义 发现肯定的致病原如新生隐球
5、菌时，诊断即可确立。分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉，应结合临床情况进行判断。无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染，但对来自于脓、痰或尿的标本则应谨慎解释结果。但任何一株培养物都不应轻易视为污染菌。需结合直接镜检的结果，强调直接镜检与培养检查相结合的重要性。强调临床医师与实验室检验人员之间的相互联系。,19,092,20,区分酵母样或霉样菌落,21,Aspergillus fumigatus-Colonial Morphology,Sabouraud葡萄糖琼脂培养基烟曲霉菌,22,Aspergillus fumigatus-Microscopic Morphology,1
6、00 x Lactophenol cotton blue(单列)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、分生孢子,23,Aspergillus flavus-在Sabouraud葡萄糖琼脂黄曲霉菌生长快黄色表面粉末状,24,Aspergillus flavus-Microscopic Morphology,100 x Lactophenol cotton blue 黄曲霉菌(二列为主)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、梗基、分生孢子,25,Penicillium species-Colonial Morphology,Sabouraud agar 青霉属 气生菌丝密毯状,26,Penicilli
7、um species-Microscopic Morphology,400 x Lactophenol cotton blue青霉属(帚狀枝,分生孢子),27,Aspergillus niger-Colonial Morphology,Sabouraud agar黑曲霉菌,(背面),28,Aspergillus niger-Microscopic Morphology,100 x Lactophenol cotton blue(二列为主)分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、瓶梗、梗基、分生孢子,29,真菌体外药敏试验,30,真菌体外药敏试验,1 K-B 法2 MIC 法3 E-test 法,31,液
8、基稀释法CLSI M27A2：致病性酵母菌 CLSI M38A：产孢丝状真菌琼脂稀释法纸片扩散法CLSI M44-AEtest法,抗真菌药物体外敏感试验,32,33,E-test法：可用于酵母样真菌和丝状真菌,34,096,35,白色念珠菌,近平滑念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,36,白色念珠菌,近平滑念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,37,白色念珠菌,近平滑念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,38,白色念珠菌,近平滑念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,39,白色念珠菌,近平滑念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,40,白色念珠菌,近平滑念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,41,体外抗真菌药敏试验与体内疗效,90
9、-60原则MIC值与临床疗效 药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效 药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效 Mahmoud A.G,JCM 1996,34:489-495；Rex J,CID 2002,35:982-989,42,真菌特异性抗原的免疫学检测,1(1-3)-D-葡聚糖 2 半乳甘露聚糖 3 甘露聚糖 4 D-阿拉伯糖醇 5 烯醇化酶 6 新生隐球菌荚膜抗原,43,(1-3)-D-Glucan(葡聚糖)“G”试验,44,(1-3)-D-Glucan生物活性,(1-3)-D-Glucan作为真菌细胞壁成分之一，一旦进入机体后，将引起真菌病，严重时将会引起严重的深部真菌感染疾病，因此,深部真
10、菌感染对患者的健康与生命构成严重威胁.,传统检测方法为真菌培养，一是周期长，二是阳性率特别低主要是抗生素类药物的滥用所引起真菌感染出现逐渐上升趋势,45,“G”试验缘何而来？,46,比浊法反应机理,细菌内毒素（1-3）-D-GlucanLAL-RM(反应物)因子C活化因子C 因子B活化因子B 活化因子G 因子G凝固酶原 凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶）定量浊度仪Turbidimetric technique GEL,47,G 试验,1-3-D-Glucan 葡聚糖存在于念珠菌、曲霉等的细胞壁中，能特异性激活G因子，从而激活鲎试验，此过程称为G试验。口咽部念珠菌病G试验结果阴性隐球菌,毛霉菌感染
11、G试验假阴性,48,(13)-D-葡聚糖检测,是酵母菌及丝状真菌细胞壁上的一种成分内毒素检测方法应用范围：曲霉菌、念珠菌、镰刀霉、毛孢子菌、酵母菌、足分支菌隐球菌、毛霉菌除外已在美国FDA以及一些欧洲国家得到批准,49,(13)-D-葡聚糖检测,美国主要针对念珠菌血症进行了研究需要更多有关其它感染的研究信息（侵袭性曲霉菌病）没有真菌感染的患者血液中也会出现-D-葡聚糖：-血液透析-使用血制品（白蛋白、丙球）-使用含有葡聚糖的纱布临床上阳性结果出现较晚使用某种抗生素是否会导致假阳性？,50,G试验商品化试剂盒detects in one hour 1 天津滨海新区金山川公司生产产品 2 Fung
12、itec-G glucan(Seikagaku)Obayashi 1992 cutoff：20pg/ml 3 FungitellTM Assay(Associates of CAPE COD)cutoff：80 pg/ml,51,1 输注白蛋白或球蛋白2 血液透析(纤维素滤膜）3 输注抗肿瘤多糖类药物4 使用磺胺类药物5 外科手术后早期6 标本接触纱布,G试验假阳性问题,52,酵母菌、丝状真菌细胞壁成分不仅检测曲霉菌，还可以检测念珠菌、镰刀菌、毛孢子菌、支顶孢属不能检测：隐球菌和接合菌美国FDA已批准，欧洲部分国家已注册敏感性、特异性：90左右,D葡聚糖的价值,53,D葡聚糖（G试验）的缺陷标
13、本采集不能鉴定何种真菌感染,54,D葡聚糖参考值,健康人：20 pg/ml,55,The cutoff of G test,Clinical Infectious Diseases 2005;41:654-9,The cutoff of G test,56,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）,57,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）,Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay,58,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）,曲霉菌细胞壁上一种多聚糖抗原可以从血清、脑脊、胸水、BALF检测到方法：ELISA（BioRad）：敏感性高 1ng/mlLate
14、x agglutination：15ng/ml,59,影响GM检测的因素,宿主曲霉菌疾病谱高危患者的治疗GM的其它来源GM的循环动力学抗GM抗体真菌曲霉菌种类？营养情况GM释放的动力学？,策略采样频率标本种类阳性定义试验设计方法Cut-off方法/实验室内差异手工 vs 自动化,60,GM试验假阳性问题,以乳或乳制品为主食的婴幼儿异体骨髓移植患者菌血症患者自身抗体阳性患者使用半合成青霉素,61,GM与内酰胺类抗生素,GM与哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、青霉素V有交叉反应错误地提高了诊断的确定性,62,合适的判定折点：1.0,0.7,0.5?在儿童的应用价值？食物中的GM可以
15、被吸收，假阳性？哌拉西林/他唑巴坦治疗，假阳性？非血液病患者应用不多抗真菌治疗对结果的影响？,半乳甘露聚糖(GM)检测存在的问题,63,两种试验敏感性、特异性相当都可以在早期诊断侵袭性曲霉病，但是D葡聚糖可能出现更早两者结合，可以互补弥补GM假阴性可能同样在粒细胞缺乏患者用的多，其他患者有待研究,半乳甘露聚糖(GM)与D葡聚糖的比较,64,血清抗体检测 由于患者存在免疫受损，抗原递呈功能和及淋巴细胞功能受损，不能产生足够的抗体。诊断价值较低。,65,系统性真菌感染诊断的进展,66,检测真菌的特异性酶,白念N-乙酰-D半乳糖苷酶白念脯氨酸按肽酶都柏林念珠菌 N-乙酰-D半乳糖苷酶克柔 酸性磷酸酶
16、热带 吡烙磷酸酶平滑-D半乳糖苷酶新生隐球菌 酚氧酶,67,P C R,通过扩增曲霉菌特异基因片断，达到快速诊断的目的，但容易污染。,68,PCR诊断侵袭性真菌病,一种可能的全真菌检测方法可能用来进行血清学筛查（早期诊断）方法和标本不同，敏感性及特异性不同底线：有诊断潜能，但还不是最佳的方法 Alexander B,Transpl Infect Dis,2002,(supply 3):32,69,发热期间至少有一瓶血培养真菌阳性持续稳定的血念珠菌抗原阳性 或高的抗念珠菌抗体滴度(ELISA),真菌菌血症实验室诊断指标：,70,需要解决的问题,重视基础真菌学检验，将直接镜检与真菌培养方法联合应用
17、；注重寻找组织学证据这一诊断的“金标准”，寻找病原真菌入侵机体的直接证据；对诊断新方法应严格评价并对其进行标准化和规范化；加强临床与实验室之间、实验室与实验室之间的交流与协作。,71,微生物标准-1,痰液或支气管肺泡灌洗液培养呈霉菌（包括曲霉属、镰刀霉属、接合菌和放线菌属等）或新生隐球菌阳性；痰液或支气管肺泡灌洗液经直接镜检或细胞学检查，发现霉菌或隐球菌；鼻窦抽取液直接镜检或细胞学检查，或培养呈霉菌阳性,72,微生物标准-2,血液真菌培养阳性无菌体液中，经直接镜检或细胞学检查，发现除隐球菌外的其它真菌未留置尿管的情况下，连续两份尿样培养均呈酵母菌阳性未留置尿管的情况下，尿检见念珠菌管型,73,微生物标准-3,支气管肺泡灌洗液、脑脊液或2份以上的血液样品呈曲霉抗原阳性肺部异常，与下呼吸道感染的相关标本中（血液、痰液和支气管肺泡灌洗液等）却无法培养出任何致病菌。,74,小结,1 建立完善的真菌实验室：鉴定，药敏2 提高送检率和送检合格的标本，实验室前质控：“活检病理标本微生物标本”3 开展G 试验和GM 试验等免疫学检验 和分子生物学试验为临床提供多种可靠的实验诊断依据,75,谢谢！,
