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1、菊花的组织培养,指植物的离体部分（包括任何器官、组织、细胞或原生质体），在人工控制的培养基及环境条件（温度及光照）下，得以生长和分化成完整植株的一种无菌培养技术。,又称：植物离体培养,一、植物组织培养的概念,1、离体,2、无菌,3、营养物质：,4、激素：,5、其他外界条件：,大量元素,微量元素,有机物,生长素,细胞分裂素,pH值,温度,光照,1、概念：细胞的全能性是指已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能。2、原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质都有发育成为完整个体所必需的全部基因,植物组织培养原理：,植物细胞的全能性,植物全能性的表达,离体的植物器官、组织、细胞,胚状体,
2、根、芽,愈伤组织,人工种子,再生植株,高度分化的动物细胞，全能性受到限制。但细胞核仍然保持着全能性,已分化的植物细胞，仍具有全能性,3、实例,受精卵胚胎干细胞其他干细胞体细胞,4、全能性的比较:,细胞的分化,概念：,在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程,过程：,如：受精卵增殖、分化 形成组织、器官、系统,实质：,基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果,结果：,形成不同的细胞和组织,特点：,（2）稳定性：,（3）全能性：,（1）持久性：,是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度,细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的,已分化
3、的细胞，仍具有发育的潜能,3、植物组织培养过程:,离体组织或细胞,植物体,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,不需要光,需要光,愈伤组织,愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态 的 薄壁细胞,来源：由离体组织、细胞 脱分化产生,不具有叶绿体，不能进行光合作用，生命活动要由培养基提供能量。分裂能力强，可用于细胞培养，基因突变,二、影响植物组织培养的因素：,1、外植体的选取 不同植物的组织培养难度不同 同一种植物的不同组织培养难度不同2、培养基的配制(MS培养基)大量元素：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：Fe、Mn、B、Z
4、n、Mo、Cu、I、Co 有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等 植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等,未开花植物的茎上部新萌生的侧枝,讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。,3、不同植物激素使用顺序
5、,4、不同植物激素使用量,思考：以下培养基出现的现象反应了什么问题？,生长素/细胞分裂素 高,生长素/细胞分裂素 低,5、pH、温度、光照（菊花组培）pH=5.8 温度控制在1822 再分化需要光照,每日光照12h6、消毒在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境,5.植物组织培养应用快速繁殖：运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自一单一的个体，遗传性状一致。例如一株葡萄一年繁殖到3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。,种苗脱毒：由于病毒的感染严重影响作物的产量和品质，而利用组织培养技术可以有效地除去植物体内的病毒，得到大量的无病毒种苗。主要的方法是培养植物茎尖
6、分生组织，也可以采用热处理或加入化学试剂的方法达到脱毒的效果。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。,远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。,potato,tomato,突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生 生物制品：有些极其昂贵的生物制品，可以用大规模培养植物细胞来直接生产 种质保存：繁殖量大，省空间，保存时间长,制备MS固体培养基,外植体消毒,接种,培 养,栽 培,四、实验操作,移 栽,二、实验操作,
7、（一）制备MS固体培养基,MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备,1、配置各种母液,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存,激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,2、配置培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml,配制培养液,调PH,培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体消毒,2、消毒
8、,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右,酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰
9、灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,3、材料的切取和接种,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分,思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，
10、没有被杂菌污染。,（四）培养,1、愈伤组织的培养,从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。,在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色,2、试管苗的培养,当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段
11、时间,（六）栽培,3、移栽,珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培,幼苗长壮后，移栽到土壤中,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,三、课题延伸,1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养,2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季,1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。,在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？,结果分析与评价,（一）对接种操作中污染情况的分析（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（三）是否进行了统计、对照与记录（四）生根苗的移栽是否合格,课题延伸（略）,练习1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。2.答：外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。,菊花组织培养,基础知识,实验操作,植物体的组织培养,影响组织培养的因素,细胞分化细胞全能性组织培养过程,营养激素环境条件,MS固体培养基制备外植体消毒接种培养移栽栽培,
