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1、第五节 藻类和原生动物,最初，藻类和原生动物分别被看作是低等植物和低等动物。主要依据它们的营养方式进行鉴别，藻类具有叶绿体，营养方式为光能自养（photoautotrophic）；原生动物则依靠吞噬营养（phagotrophic）或渗透营养（osmotrophic）。然而，藻类和原生动物之间的区别从来就没有完全弄清楚。过于20多年中，对于单细胞真核生物（algae、protozoa、lower fungi）的进化和系统学研究异常活跃。在这一时期，许多分类学的界限被打破，建立了新的系统发育关系。,尽管藻类和原生动物没有真正的系统发育关系和进化关系，但一些研究者还是将它们称为原生生物（protis
2、ts）或protoctists。而另一些研究者提出的分类系统中，虽然对某些定义和界限作了很大的修改，仍保留了原生动物界（Protozoa），而藻类则分属于几个不同的界：植物界（Plantae）、Chromista和原生动物界（Protozoa）。,尽管如此，“藻类”和“原生动物”在功能和生态学意义上仍然是非常有用的，分别定义为光能自养原生生物（photoautotrophic protists）和异养原生生物（heterotrophic protists）。此外,还要介绍另一群原核生物蓝细菌（cyanobacteria）培养问题。藻类和原生动物都是水生生物。尽管在陆生环境中（如土壤），也普遍存
3、在藻类和原生动物，地衣则是藻类和真菌的共生体，但是必须有充足的水分，它们才能活动。,藻类和原生动物在水生环境中的生态学重要性正日益被人们所认识。如在许多水生环境中，藻类是主要的初级生产者（primary producer），在海洋水体中，占总生物量和初级生产力的80%。藻类还是水体质量的重要指示生物（bioinducer），用于评估和监测水体系统的健康状况。,另一方面，需要特别关注的是，当藻类密度达到一定值时，足以形成表面浮膜或引起饮用水变味。水华（藻华）（algal bloom），尤其是微囊藻属（Microcystis）、颤藻属（Oscillatora）以及其他属的一些产毒素的蓝细菌形成的水
4、华，严重影响到水体的质量，尤其是饮用水供应部门所要面对的一个严重问题。,原生动物在海洋食物链中是初级生产者的主要消费者；同时又是浮游生物（plankters）的重要食物资源。在沙土、沉积物、有机物污染的水体以及好氧废水处理工艺中，原生动物是微型藻和细菌的最主要的消费者。它们也是有机物污染和废水质量的指示生物。此外，海洋原生动物形成的赤潮（red tides），伴随着产生环境毒理生物学问题。,要对上述问题进行深入的研究，必须对有关的藻类和原生动物进行准确的鉴定，而鉴定工作常常取决于在实验室中培养这些生物的能力。获得藻类和原生动物的纯培养是对其进行基础研究、应用研究和开发利用的基础。,一、分离方法
5、（Isolation Methods）富集（enrichment）：将一个野外样品（field sample）接种到一个等体积或更大体积的合适培养基中，然后在适宜的条件下进行培养。这样通过在不同培养基中，进行一系列不同的平行接种，就可将不同的生物选择出来。,1）固氮蓝细菌（nitrogen-fixing cyanobacteria）的富集：将样品接种于合适的缺乏氮源的无机盐培养基（mineral medium）中，如BG11中不加NaNO3（see Table2），就可以选择出固氮蓝细菌（nitrogen-fixing cyanobacteria）；2）食细菌原生动物（bacterivorou
6、s protozoa）的富集：添加蒸煮的大麦、小麦、大米等谷粒，促进细菌的生长，为原生动物提供食物。3）富集并不能保证获得单一原生生物的培养物，但可以增加目标生物的细胞数量，有助于对其进一步的分离。,稀释（dilution）：从某种原生生物占优势的样品中分离该生物，稀释法是最有效的。用合适的培养基对样品进行系列稀释，然后在适宜的条件下进行培养。在最大稀释度的培养液中生长的生物很可能就是单一原生生物。但稀释法并不能保证获得的培养物是纯系的（clonal），更不可能获得一个纯菌株（axenic strain）。,物理方法（physical mathods）：1）显微操作法：在解剖显微镜下，选择原生
7、生物的个体单元，用薄壁毛细移液管转移到一个无菌的培养基中，在适宜环境条件下进行培养。这种方法适合于多种原生生物，特别是那些体积大、移动慢的原生生物的分离。然而这种方法需要技巧和耐心，而且不适于体积微小的原生生物的分离。,通常，进行一次操作，并不一定能获得一个单一的纯培养物，可以对已分离的细胞进行洗涤和二次转移，多次反复，就能成功地获得纯培养（axenic culture）。,对于一些体积小、能移动的原生生物，可以利用显微操作器（micromanipulator）和琼脂孔穴通道分离技术相结合进行分离。2）其他物理方法：选择性过滤（selective filtration）、硅酮油平板法（sili
8、cone oil plating）、密度梯度离心（density gradient centrifugation）和流式细胞计量术（flow cytometry）。,琼脂平板法（agar plating）：主要用于藻类、阿米巴（变形虫）和某些鞭毛藻的分离。,二、保藏方法（Maintenance Mehtods）1.藻类(algae)培养基和保藏方式的选择取决于藻类分离物(isolates)的营养需求和当地的可利用的原料资源。1）培养基（Media）BG11（blue-green algalcyanobacterial medium）（Table2）：为分离和培养蓝细菌而设计的培养基，也适合于多
9、种真核微型藻（eukaryotic microalgae）的培养。,JM（Jaworkis medium）（Table3）:适合于多种淡水和陆生真核藻类的培养。如果在该培养基中添加57g/L NaSiO3.9H2O，也可用于硅藻(diatoms)的保藏。若在该培养基中添加一定量的有机物（醋酸钠和复杂氮源），就可用于培养混合营养型和光能异养型藻类。,GUI（Guilliards f/2 medium）:用于培养多种海水微型藻.2)定期传代(periodic subculturing)在保藏过程中,需要进行定期的传代培养.一般按0.5-10%的接种量,将接种物无菌转移(aseptic transf
10、er)到无菌培养基(sterile medium).,3)保藏条件(Maintenance conditions)最适温度（optimal temperature）：绝大多数藻类的菌株可 以在15-20下保藏；对于一些分离自极端环境（extreme environments）的菌株，应尽可能地采用与其环境一致的温度进行保藏；此外，特别要注意保藏温度不能超过藻类的最高温度（temperature maximum）。,光照（light）：最好采用控温光照培养箱（illuminated incubators）；用冷白荧光管，按照16h-8h的明-暗方式（light-dark regime）进行照射；
11、来自北向窗子的自然光也是非常合适的。对光照水平也有一定的要求，大多数藻类的光照水平为50mol光子/m2s左右；而蓝细菌的光照水平为25mol光子/m2s。,2.原生动物(Protozoa)1）培养基（culture media）分为四种主要类型：植物浸汁（plant infusions）、土壤浸出物培养基（soil extract-based media）、无机盐溶液（inorganic salt solutions）、专一性培养基（specific media）（Table5）。,植物浸汁（plant infusions）：植物浸汁用于培养食细菌鞭毛虫（flagellates）和纤毛虫（c
12、iliates）。常用的植物材料有：大米、小麦或大麦粒、干草（hay）、莴苣（lettuce）、谷物叶子。用蒸馏水或无机盐溶液,按0.1-0.25%(wt/vol)的含量配制。特别要注意，植物材料的量不能过多，否则会促进细菌的过渡生长，而抑制原生动物。对于一些海生原生动物，植物浸汁可用天然或人工海水配制。,土壤浸出物培养基（soil extract-based media）：取1份风干、过筛、pH7.0的土壤，加入到2份蒸馏水中，15lb/in2灭菌1h，然后放置一周，制备成土壤浸出物储备液。使用时，根据需要用蒸馏水或无机盐溶液稀释到3-10%（vol/vol），并添加一定量的谷粒或碳酸钙。,
13、无机盐溶液（inorganic salt solutions）：无机盐溶液是一个离子平衡培养基，其离子组成适合于多种原生动物的生长。但是，由于其缺乏有机营养，因此，必须添加一些可食生物或供可食生物生长的有机碳源。无机盐溶液分为天然和人工合成的两种类型，天然的无机盐溶液有淡水、海水、矿泉水等，通过过滤，即可使用；人工合成的无机盐溶液有Prescotts 和Jamess solutions.,专一性培养基（specific media）：为特定目的而设计的培养基，其最终目的是获得原生动物的纯培养。目前，已经获得了许多原生动物的纯培养，如鞭毛虫Astasia、Euglena、Chilomonas，纤毛虫Tetrahymana、Paramecium。所用的培养基为限定培养基或半限定培养基。它们都含有相对较高浓度的可溶性有机碳源，以便使原生动物能够通过渗透方式获取营养物质；除酵母粉（yeast extract）外，通常都是动物材料加工而成的，如肝粉（powered liver）、眎蛋白胨（proteose peptone）、牛肉膏（beef extract）等。最常用的是眎蛋白胨酵母分培养基（PPYE）。,2）保藏条件 需要考虑的保藏条件：温度、pH、氧浓度、食物类型和浓度、培养基的类型和浓度、培养容器类型和容量以及接种物的种龄、大小和密度。,
