血栓与止血检验.ppt

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1、第十三章 血栓与止血检验,编辑制作 熊石龙,一、基本理论,血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层内层：内皮细胞+基底膜 内皮细胞管壁有肝素类物质 内皮细胞内含细胞器（棒状小体 vWF和t-PA，TM，AT-,PAI-1等）中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层）外层：结缔组织,血管壁的结构,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,激活血小板,激活凝血过程,抗血栓特性,收缩反应,血管壁的止血功能,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,一、基本理论,血小板的止血功能,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血管损伤（抗血栓特性降低）血管收缩 激活凝血过程 血流减慢 纤维蛋白形成 血管内皮下成

2、分暴露 血小板黏附、聚集、释放 血栓形成,血浆血管性血友病因子抗原vWF:Ag，ELISA法,原理纯化的兔抗人vWF:Ag抗体包被聚苯乙烯反应板，加入稀释的待测血浆，样本中的vWF:Ag结合于固相的抗体上，然后加入酶标记兔抗人vWF:Ag抗体，与其定量结合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲线，即可计算出vWF:Ag的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,二、血管壁（内皮）检验,vWF:Ag 操作,单抗以0.1mol/L的碳酸盐缓冲液（pH9.5）稀释成10g/ml加入反应板中，每孔0.2ml，置于湿盒中4过夜。0.05%Tween20，0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH

3、7.4，TweenPBS）洗3次后加入用0.4%BSAPBS稀释的待测血浆或培养液上清，每孔0.2ml，37温育2小时。同前洗涤3次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标vWF单抗，每孔0.2ml，37温育2小时。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,vWF:Ag 操作,同前洗涤5次后，每孔加底物溶液（OPD 1mg/ml，用0.1ml/L，pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制，30%过氧化氢0.5g/ml）0.2ml，置室温约5分钟后，各孔加3mol/L硫酸0.05ml终止反应。室温放置10min后在酶标仪上测定492nm处的吸光度值。绘制标准曲线 正常混合血浆以0.4%BSAPBA按1：20、1：

4、50、1：100、1：200、1：500、1：1000六种浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,参考值：61.6%126.6%注意事项对血浆vWF：Ag浓度过高的标本，应稀释后再测定。所有ELISA测定中应注意的事项均应引起重视。除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,vWF:Ag 参考区间,vWF:Ag 应用评价,血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断 1.减低 见于血管性血友病（vWD），是诊断vWD及其分型的重要依据2.升高 见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（ASC）、心肌梗死

5、、脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见 于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。应用评价以前vWF：Ag定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现在少用。ELISA常用于定量检测vWF：Ag，但是胶乳增强的免疫比浊法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,凝血酶调节蛋白，TM,原理将抗人凝血酶调节蛋白（Thrombomdulin,TM）单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的TM结合于包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM单抗，根据结合的125I放射性强度计算出样品中TM的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,

6、TM 操作,1.绘制校正曲线 人TM标准品用缓冲液A做倍比稀释，TM的浓度分别为500，250，125，31.25，15.6，7.3,3.9和0ng/ml,以人TM浓度为横坐标，以cpm为纵坐标绘制校正曲线。2.将200l的抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，4过夜，用洗涤液A洗3次，将待测样本（或标准品）0.25ml与等量缓冲液A混合，每小杯加入20l稀释样品液（空白管加入缓冲液A），37水浴2h，用洗涤液A洗3次，加入200l125I-抗人TM单抗，37水浴2h，再用洗涤液B洗六次，在闪烁测定仪上测定放射活性，在校正曲线上查出相应的浓度。TM 参考区间 2552g/L,第十三章 第一

7、节 血管壁的止血作用及检验,TM是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞表面，和循环血液中的凝血酶形成1：1的TM-凝血酶复合物，此复合物将蛋白C（PC）激活为活化蛋白C（APC），APC有灭活Fa、Fa和激活纤溶活性的作用，因此TM对于血管的抗凝作用十分重要。正常情况下，血浆中TM的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的TM含量明显升高且与内皮的损伤程度相关。目前认为，TM:Ag的检测是了解血管内皮损伤最好的指标。TM:Ag的水平升高 见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓形成（DVT）、DIC等。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,TM 应用评价,TM

8、 注意事项,1.如果样品不能当天测定，应在采血后立即将血浆分离出放于-20冷冻保存。冷冻的样品复溶时应在37水浴中进行，室温中缓慢解冻则可导致TM沉淀。2.若样本中的TM含量超过校正曲线范围应适量稀释后再次测定。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测,原理 ELISA法：将抗原（血浆6-酮-前列腺素F1-牛血清白蛋白连接物）包被于固相载体上，与游离抗原（待测样品或6-酮-前列腺素F1标准品）竞争性地与一定量的抗6-酮-PGF1抗体结合，洗涤后加入过量的酶标记第二抗体，再加入底物显色。待检血浆或标准品中的6-酮-PGF1含量与显色程度呈负相关，根据显色程度（A值

9、）即可从标准曲线中推算出待检血浆中6-酮-PGF1的含量。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测 操作步骤,1.标本采集 顺利采取静脉血后与5%EDTA-Na2进行9：1抗凝混匀，3000r/min离心20min分离出血浆。2.用碳酸盐缓冲液将6-酮-PGF1-BSA作一定稀释后包被于酶标反应板，再用0.3%明胶封闭。加入标准品（倍比稀释成12.51600pg/ml 浓度）或待测样品、兔抗6酮-PGF1IgG100l后在37中温育2h。洗涤后再加入酶标第二抗体200l在37反应2h。以OPD-过氧化氢为基质显色20min，加入3mol/L硫酸中止反应，在酶标检

10、测仪上测定490nm处的吸光度值A。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测 参考区间,标准曲线与计算式中:B为测定管；B0为不加样品管，最大结合率管；B/B0为结合率。以标准品含量为横坐标，B/B0（%）为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。根据样品孔B/B0（%）值在标准曲线上读出6-酮-PGF1的含量。样品6-酮-PGF1浓度（pg/ml）=测定值10。参考范围10.725.1 pg/ml。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,血浆6-酮-前列腺素F1检测 应用评价,血浆6-酮-前列腺素F1是血管内皮细胞膜上PGG2和PGH2代谢的终末产物，检测血浆

11、中6-酮-前列腺素F1的水平能客观的反映血管内皮的功能，有助于对血管内皮损伤程度的了解和疗效评价。血浆6-酮-前列腺素F1减低 见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、动脉粥样硬化、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。,第十三章 第一节 血管壁的止血作用及检验,了解血小板的超微结构，在此基础上理解血小板的止血功能。理解并掌握血小板止血功能实验室检查的临床应用及评价。,学习要点,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,第二节 血小板止血作用及检验,一、基本理论,血小板（blood platelet）由骨髓中成熟巨核细胞的胞 质分割生成，是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。血小板

12、数量：(100300)x109个/L（成年人）。血小板寿命：710天。主要功能：促进止血和加速凝血，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中起重要作用。,血小板概述,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板结构,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,光学显微镜：一般表现为多形态，直径14m，具有运动和变形能力。瑞氏染色后见血小板胞质呈灰蓝色或淡红色，无胞核，中心部位有较多紫红色嗜苯胺蓝颗粒。电子显微镜：血小板结构由外向内可分为表面结构、溶胶质层结构和细胞器内含物三层。,1血小板表面结构 由血小板膜、细胞外衣和开放管道系统（open canalicular s

13、ystem，OCS）组成。重要成分：磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）/血细胞第3因子（PF3）血小板膜糖蛋白等。2溶胶质层结构 由微管、微丝、致密管道系统等组成。3细胞器内含物结构 主要致密颗粒和-颗粒、溶酶体组成。,血小板超微结构功能基础,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,花生四烯酸是膜磷脂代谢产物，其代谢途径是血小板发挥聚集止血功能的主要代谢基础。,血小板的花生四烯酸代谢途径,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附,促凝作用,血小板聚集,释放反应,血块收缩,血小板的止血功能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板的止血功能,血小板的止血功

14、能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板的主要释放产物,血小板功能的实验室检查,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附实验 PAdT，玻珠柱法,原理 血小板粘附试验（platelet adhension test，PAdT）利用血小板在体外可黏附于玻璃表面的原理设计，测定方法有多种，包括玻珠柱法、玻球法等。当血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后，血小板粘附于玻璃表面，因此血液中血小板数会降低。通过计数接触前、后的血中血小板数，即可计算出血小板粘附率。该试验为判断血小板粘附能力的常用指标。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAdT 操作,将玻珠柱管（内径3mm，长9

15、.4cm，内装直径0.30.5mm玻珠1.5g，管两端封以0.05cm孔径的尼龙布）与注射器相连；行肘正中静脉穿刺；当血液接触玻珠时开始计时，掌握好血液通过玻珠柱的速度。在4等分的玻珠柱中，血液通过每段速度为5s，共20s。经过玻珠柱后，再按原速抽血5s；采集通过玻珠柱前后的血液，作血小板计数。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板粘附率（%）=100%参考值：62.5%8.6%注意事项取血过程必须顺利，掌握血液通过玻珠柱的速度。待用玻珠柱应置于干燥器中储存，受潮后粘附率下降。血小板计数要准确，宜作23次后取平均值。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAdT 参考区间,PAd

16、T 应用评价,血小板粘附率减低：见于先天性和继发性血小板功能异常（以后者多见），如血管性血友病、巨大血小板综合征、爱-唐综合征、低（无）纤维蛋白血症、异常纤维蛋白血症、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、肝硬化、尿毒症、服用抗血小板药物等。血小板粘附率增高：见于血栓前状态和血栓形成性疾病，如高血压病、糖尿病、妊娠高血压综合征、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、口服避孕药等。应用评价 是检测血小板功能的基本试验之一，用于遗传性与获得性血小板功能缺陷疾病的诊断、血栓前状态和血栓性疾病检查以及抗血小板药物治疗监测。但特异性差，操作较复杂，

17、易受较多人为因素的影响，致使其在临床的实际应用受限。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板聚集实验 PAgT,原理 当一定数量的诱导剂存在时血小板即发生聚集。以贫血小板血浆（PPP）设定最低浊度（100%透光度），富血小板血浆（PRP）设定最高浊度（0%透光度）。在PRP血浆中加入诱聚剂诱导血小板聚集，测定血浆浊度的变化，绘制血小板聚集曲线。通过分析血小板聚集曲线的最大聚集率（MAR）、达到最大幅度的时间、达到1/2最大幅度的时间、2min的幅度、延迟时间、斜率参数判断血小板的聚集的程度和速度。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAgT 操作,1.用硅化注射器从肘静脉取血4.

18、5ml，注入含0.5ml 109mmol/L枸橼酸钠的硅化或塑料离心管中，充分混匀；2.以1000r/min室温下离心10min，分离PRP，小心取出上层血浆，计数血小板并调至（100200）109/L；将上述剩余血液以3000r/min离心20min，分离PPP（上层较透明的液体），血小板计数一般要求低于20109/L；3.按照不同的聚集仪的要求，吸取所需的PRP和PPP置于比色杯中，分别调整好透光度为10和0；4.打开记录仪走纸开关，描记10s的PRP基线，随后将适量诱聚剂（视仪器要求而定，一般为反应体系总量的1/10左右）加入PRP中，并开始搅拌，记录浊度改变曲线，测定时间一般为610m

19、in。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,不同仪器及诱聚剂或者不同浓度、剂量的同种诱聚剂有不同的参考范围。MG-196型血小板聚集仪为例，几种常用的诱聚剂测得的参考值:,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAgT 参考区间,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板聚集曲线,PAgT 应用评价,应用评价 本试验是检测血小板功能的基本试验之一，试验简便、快速，成本低廉，在临床上开展比较广泛。血小板聚集率减低：见于血小板无力症、血小板贮存池病、血管性血友病、巨大血小板综合征、低（无）纤维蛋白原血症、肝硬化、尿毒症、维生素B12缺乏症、细菌性心内膜炎、急性白血病、骨髓增生异常综合征、

20、骨髓增殖性疾病、特发性血小板减少性紫癜、服用抗血小板药物等。血小板聚集率增高血液高凝状态和（或）血栓形成性疾病，如动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、深静脉血栓形成、高脂饮食、口服避孕药和吸烟等。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PAgT 注意事项,标本采集后置于室温（25C左右）下保存,并在3小时内完成试验;试验前至少1周应停用一切抑制血小板聚集的药物，如阿司匹林、潘生丁、肝素、双香豆素等。采血前一天应避免使用牛奶、豆浆等高脂肪食物以免影响悬液透光度。抗凝剂应选用枸橼酸钠，而忌用EDTA。注意诱聚剂的保存，如ADP在保存过程中会自行分解产生AMP，

21、故配制后溶液应保存与-20C冰箱，但保存一般不应超过6个月；肾上腺素应避光防止减少分解。此外，诱聚剂的种类和浓度对血小板聚集结果都有影响，临床判断是应注明所用诱聚剂的种类和浓度。各实验室也应建立自己的参考值。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板第3因子有效性测定（PF3aT,原理 PF3是血小板活化过程中形成的一种膜表面磷脂成分（即磷脂酰丝氨酸），是血小板参与凝血过程的重要因子。试验将正常人与受检者的PRP(富含血小板血浆)和PPP（贫血小板血浆）交叉组合,利用白陶土作为血小板活化剂，氯化钙作为凝血反应启动剂，促进PF3形成。通过测定各组标本的凝固时间，比较各组时差，了解受检者PF

22、3是否有缺陷。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PF3aT 操作步骤,采血，待测血样和正常对照血样各一份，加入抗凝剂混匀；分别制备PPP和PRP；准备四只试管，按下表加样；将上述4只试管置于37C水浴预温2min后，依次加入白陶土悬液0.2ml，并记录时间；加入白陶土20min后，向小试管中依次加入0.025mol/L氯化钙0.2ml，开动秒表测定凝固时间。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PF3aT 参考区间,第1组较第2组延长如超过5s以上，即为PF3有效性减低。第3组、第4组分别为患者和正常人（作为对照管），患者PF3有缺陷或内源凝血因子有缺陷时（如血友病），第3组凝固时

23、间比第4组长。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,PF3aT 应用评价,应用评价 PF3aT是最常用的血小板凝血活性检测试验，方法简单，易于操作。PF3有效性减低：见于先天性血小板PF3缺乏症、血小板无力症、巨大血小板综合征、肝硬化、尿毒症、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、骨髓增生异常综合征、急性白血病及服用抗血小板药物等。PF3有效性增加：常见于高脂血症、动脉粥样硬化、心肌梗死、糖尿病伴血管病变等。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板膜糖蛋白测定,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板膜糖蛋白（Glucoprotein，GP）是血小板功能和

24、血小板与其他活性物质作用的基础，一些糖蛋白如GP Ia、GP Ib、GP IIb、GP IIIa等已被确定为血小板特异抗原。GP 分子数量或结构异常均可导致出血或血栓形成。活化血小板与静止血小板相比，GP 的种类、结构、含量等亦呈现显著变化。可使用ELISA或流式细胞术（FCM）分析血小板膜糖蛋白的表达。,主要血小板膜糖蛋白及功能,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板自身抗体测定,血小板自身抗体包括：血小板相关免疫球蛋白（platelet associated immunoglobulin，PAIg）（包括PAIgG、PAIgA、PAIgM）特异性膜糖蛋白自身抗体 药物相关自身抗体

25、抗同种血小板抗体血小板自身抗体测定表达有助于判断血小板减少的原因。检测血小板免疫相关球蛋白的常用方法为ELISA及流式细胞术。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板相关抗体测定的应用评价,特发性血小板减少性紫癜（ITP）：90%以上的病人PAIgG增加，同时测定PAIgA、PAIgM及PAC3阳性率达100%。ITP病人在皮质激素治疗后，PAIgG不下降可作为切脾的指征。ITP疗效监测指标，治疗有效上述指标下降，复发则增加。其他疾病：如同种免疫性血小板减少性紫癜（多次输血后）、Evans综合征、药物免疫性血小板减少性紫癜、慢性活动性肝炎、胶原性疾病、系统性红斑狼疮、恶性淋巴瘤、慢性淋

26、巴细胞白血病、多发性骨髓瘤等PAIg也可增加。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板寿命测定,原理 利用阿司匹林可使血小板花生四烯酸（AA）代谢受阻，代谢产物丙二醛（MDA）和血栓烷B2（TXB2）生成减少，而新生血小板不受抑制，MDA和TXB2含量正常的原理，测量病人服用阿司匹林后血小板MDA和TXB2生成量恢复曲线来推算血小板的生存时间。该试验是检测血小板在体内破坏或消耗速度的一项重要试验，也称为血小板生存时间测定（platelet survival time，PST）。,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,血小板寿命测定的临床意义,血小板消耗过多性疾病：DIC等,各种血栓性

27、疾病，如：心梗、肺梗死等,血小板破坏增多性疾病，如：ITP、脾亢、SLE等,血小板生存时间缩短见于,注意：在血小板数过低时本法敏感性较低,第十三章 第二节 血小板止血作用及检验,了解血液中凝血因子及机体凝血机制的基础理论。理解并掌握凝血因子实验室检查的临床应用及评 价。,学习要点,第十三章 第三节 血液凝固及检验,第三节 血液凝固及检验,一、基本理论,14个：12个经典凝血因子 激肽释放酶原+高分子量激肽原 特殊：因子为钙离子（Ca2+）,其余均为蛋白质 除因子即组织因子外，其余均存在于新鲜血浆中 依赖维生素K的凝血因子：因子、和 接触凝血因子：因子、激肽释放酶原及高分子量激肽原。对凝血酶敏感

28、的凝血因子：因子、V、,凝血因子概述,第十三章 第三节 血液凝固及检验,凝血因子一般特点,第十三章 第三节 血液凝固及检验,1内源凝血途径 因子 因子Xa 固相激活：因子与带负荷的物质如体内的胶原、微纤维等以及体外的玻璃、白陶土等接触后，构型发生改变而被激活为a。液相激活：因子a在辅因子HMWK的参与下，水解PK使之被激活为K，K又可反馈激活因子，生成大量的a。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,2.外源凝血途径 因子 因子Xa（1）因子（TF）是一种跨膜糖蛋白，作为因子的受体，可与因子或a结合，启动外源凝血途径。（2）因子的激活 当TF结合到因子后，因子的构型发生改变随之被凝血

29、酶、Xa激活为a。因子a与TF、Ca2+形成-TF-Ca2+复合物，其形成所需时间很短，一般不超过10秒。-TF-Ca2+复合物可激活因子X和因子，使内源与外源凝血途径相联通，具有重要的生理和病理意义。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,3.共同途径 因子 纤维蛋白（1）凝血活酶的生成 因子X的激活：复合物-TF-Ca2+和a-a-Ca2+-PF3均 可激活因子X生成有活性的因子Xa。因子V的激活：在少量凝血酶的作用下，因子V被激活为Va。磷脂的作用：主要指血小板膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸（PF3）。它提供反应的催化表面。上述因子共同作用形成Xa-Va-Ca2+-PF3复合物，此

30、即凝血活酶（凝血酶原酶）。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,3.共同途径（2）凝血酶的生成 在凝血活酶的作用下，凝血酶原被水解释放出凝血酶原片段1和2（F1+2），变成凝血酶（因子a）。凝血酶是一种蛋白水解酶，其活性中心位于丝氨酸残基上，属于丝氨酸蛋白酶类。凝血酶在止血与凝血的生理和病理过程中具有多种重要作用:水解纤维蛋白原；激活因子、V、，称为凝血酶的自身催化作用；激活血小板；激活抗凝系统的蛋白C；抑制纤维蛋白（原）溶解活性。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,3.共同途径（3）纤维蛋白的形成 可溶性纤维蛋白的形成：在凝血酶的作用下，纤维蛋白原的A链和B链先后被

31、裂解，释出富含负电荷的纤维蛋白肽A（fibrinopeptide A,FPA）和肽B（FPB）后，生成纤维蛋白单体（fibrin monomer,FM），它们因负电荷减少，相互间排斥力明显降低，故能以氢键聚合。这种聚合物很不稳定，可溶于5mol/L（30%）尿素或1%单氯（碘）醋酸溶淮中（它们能解开氢键），故称为可溶性纤维蛋白单体聚合物或可溶性纤维蛋白。交联纤维蛋白的形成：在凝血酶的作用下，因子被激活为具有转谷氨酰酶活性的Xa。在因子Xa和Ca2+共同作用下，使FM链上的谷氨酸与另一个FM链上的赖氨酸以共价键交联，形成稳定的纤维蛋白。从内源凝血途径启动到纤维蛋白形成称为内源凝血系统，从外源凝血

32、途径启动到纤维蛋白形成称为外源凝血系统。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,。,二、凝血机制,第十三章 第三节 血液凝固及检验,活化部分凝血活酶时间测定，APTT,原理 在抗凝血中，加入足够量的活化接触因子激活剂（如白陶土）和部分凝血活酶（代替血小板的磷脂），再加入适量的钙离子即可满足内源凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆凝固所需的时间即称为活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）。APTT的长短反映了血浆中内源凝血系统凝血因子（、）、共同途径中凝血酶原、纤维蛋白原和因子、的水平。,第十三章 第三节 血液凝固及检

33、验,凝血因子实验室检查,APTT 操作,（一）血凝仪法1预温活化 按仪器操作方法，取正常人混合血浆0.1ml于测量杯中并加入APTT试剂0.1ml混匀，37准确孵育3min，其间轻轻摇动数次。2加钙计时 在测量杯中加入0.1ml 25mmol/L的CaCl2，仪器自动测定混合物凝固的终点并显示正常人混合血浆APTT秒数。3取待测血浆重复12的操作步骤，测定待测血浆的APTT秒数。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT 操作,（二）试管法1预温活化 加正常人混合血浆和APTT试剂各0.1ml于塑料试管中混匀，37准确孵育3min，其间轻轻摇动数次。2加钙计时 加入预温的0.1ml 25mm

34、ol/L CaCl2，混匀，并立即开动秒表计时，置水浴中不断振摇。20s后，不时取出试管观察混合液流动状态（倾斜30），当液体停止流动时终止计时，记录其秒数。一般应重复测23次取平均值。3取待测血浆重复12的操作步骤，测定待测血浆APTT秒数，一般应重复23次测定取平均值。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,每个实验室应建立所用测定方法相应的参考区间。男性(373.3)s，范围为31.543.5 s；女性(37.52.8)s，范围为3243s。待测者测定值较正常对照延长10s以上才有病理意义。,APTT 参考区间,第十三章 第三节 血液凝固及检验,1取血要顺利，血液应与抗凝剂充分混合避免发生微

35、小凝块，样品采集后在2h内完成测定。2样本测定前应测定正常人混合血浆，其APTT值在允许的范围内方可测定样本。3APTT测定因所用的激活剂不同，以及部分凝血活酶来源及制备的不同，均可影响测定结果。部分凝血活酶（磷脂）主要来源于兔脑组织（脑磷脂）。不同制剂质量不同，一般选用对因子：C、和在血浆浓度为200250U/L时敏感的试剂。,APTT 注意事项,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT 临床意义,APTT是一个临床常用、较为敏感的检测内源凝血因子缺乏的简便试验，已替代普通试管法CT测定。但APTT对诊断血栓性疾病（thrombotic disease）和血栓前状态（prethrombot

36、ic state）缺乏敏感性，也无特异性，临床价值有限。新生儿由于凝血系统尚未发育完善，多种凝血因子尤其是维生素K依赖凝血因子（FII、FVII、FIX、FX）和接触系统凝血因子（FXI、FXII、PK、HMWK）血浆水平不到成人的50%，其APTT检测将延长，一般出生后半年凝血因子可达正常成人水平。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT 临床意义,1APTT延长 主要见于：轻型血友病，可检出FVIII活性低于15%的患者，对FVIII活性超过30%和血友病携带者灵敏度欠佳。在中、轻度FVIII、FIX、FXI缺乏时，APTT可正常。vWD，型和型患者APTT可显著延长，但不少型患者AP

37、TT并不延长。血中抗凝物如凝血因子抑制物、狼疮抗凝物、华法林或肝素水平增高，FII、FI及FV、FX缺乏时灵敏度略差。纤溶亢进，大量纤维蛋白降解产物（FDP）抑制纤维蛋白聚合，使APTT延长，DIC晚期时，伴随凝血因子大量被消耗，APTT延长更为显著。其他如肝病、DIC、大量输入库血等。2APTT缩短 见于血栓前状态及血栓性疾病、DIC早期（动态观察APTT变化有助于DIC的诊断）。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,APTT 应用评价,APTT对血浆肝素的浓度较敏感，是目前广泛应用的肝素治疗监测指标。此时，要注意APTT测定结果必须与肝素治疗范围的血浆浓度呈线性关系，否则不宜使用。一般在肝素

38、治疗期间，APTT维持在正常对照的1.53.0倍为宜。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,简易凝血活酶生成试验，STGT,原理 用受检者稀释全血作为本试验中所需的全部凝血因子的来源，自身红细胞溶解产物即红细胞素代替PF3，按一定时间加入正常基质血浆（提供凝血酶原和纤维蛋白原），测定基质血浆的凝固时间，以检查内源凝血系统凝血活酶生成有无障碍。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT 操作,1取受检者全血0.4ml注入5ml蒸馏水内，混匀，使其完全溶解，此为溶血液。2取0.5ml溶血液加0.308mol/L氯化钠溶液0.5ml，混匀，37预温2min，使其变为等渗液。3于上液中加已预温的0.0

39、25mol/L氯化钙溶液0.25ml，启动秒表。同时放一竹签以挑除形成的微量纤维蛋白丝。此为温育混合液。4分别加0.025mol/L氯化钙溶液0.1ml于6支大试管内，置37水浴中，备用。5在1min45s时，吸0.1ml温育混合液注入第1支含有氯化钙溶液的试管内；在准2min时，将已预温的正常基质血浆0.1ml也加至第1支试管内，启动第2个秒表，记录凝固时间。每隔2min重复以上步骤1次，共6次。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,以最短的凝固时间作为本试验中最有价值的计数。正常人为(11.990.72)s，15 s为异常。注意事项 1等渗化的血液不宜放置过久。2温育混合液的准备要严格记时。

40、,STGT 参考区间,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT 临床意义,STGT延长（15 s），主要见于：先天性因子VIII、IX、XI缺乏；获得性因子VIII、IX、XI缺乏，如DIC、原发性纤溶以及肝脏疾病、维生素K缺乏症等；血循环中有抗凝物质，如肝素、口服抗凝剂以及其他抗凝物质等。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT纠正试验,原理 在STGT延长的受检稀释全血血液中分别加入1/100容量的正常BaSO4吸附血浆（提供F、）正常血清（、）和正常新鲜血浆（、），分别测定正常基质血浆的最短凝固时间，以确定内源性凝血活酶生成缺陷的因子。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,操作,1取

41、小试管3支，分别加入正常吸附血浆、正常血清、正常新鲜血浆各0.005ml。2于上述3支试管中，再各加受检溶血液0.5ml，再加0.308mol/L氯化钠溶液0.5ml，混匀，37水浴2min。3按测定STGT的第35步骤继续操作。,参考区间 加入各种纠正血浆或血清后，延长时间纠正到正常范围之内(即1015s)。注意事项 1吸附血浆制备时以0.1mol/L草酸钠抗凝为好。2正常血浆、血清和吸附血浆需新鲜制备。临床意义 本试验敏感性较差，尤其对因子XI、IX的缺乏评价更低，应以凝血因子活性检测来替代。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,STGT纠正试验,STGT 临床意义,第十三章 第三节 血液凝

42、固及检验,血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定,原理 受检者稀释血浆分别与缺乏因子II：C、V：C、VII：C、X：C的基质血浆混合，再加兔脑粉浸出液和钙溶液，作凝血酶原时间测定。将测得的结果与正常人新鲜混合血浆作比较，分别计算受检血浆中所含因子II：C、V：C、VII：C、X：C相当于正常人的百分率。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 操作,1取至少30人份正常人的血浆混合，以生理盐水作1：10、1：20、1：40、1：80、1：160稀释，其中以1：10稀释作为100%的促凝活性。2取各稀释标本0.1ml、缺乏因子的基质血浆0.1ml、兔脑或人

43、脑浸出液0.1ml相加并混匀，37水浴温育30S后，加入预温的25mmol/L CaCl2溶液0.1ml，在37水浴中摇动，记录凝固时间。3以所测凝固时间（S）为纵坐标，稀释标本浓度为横坐标绘制标准曲线或建立回归方程。4受检血浆用生理盐水作1：20稀释后，按上述操作取得凝固时间，通过标准曲线或回归方程，得出相当于正常人因子活性的百分比，将该值再乘以2，即为受检血浆凝血因子活性的水平相当于正常人的百分率（%）。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 参考区间,FII：C：97.7%16.7%FV：C：102.4%30.9%FVII：C：103.0%l7.3%

44、FX：C：103.0%l9.0%注意事项1样品采集后应在2h内完成测定，或分离血浆后置于-80 冰箱中，23个月内检测并避免反复冻融。2标准曲线绘制时数据可以用半对数或双对数处理。3缺乏因子的基质血浆应保证相应凝血因子的活性少于1%，而其他因子水平正常。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 临床意义,1活性增高 主要见于血栓前状态和血栓性疾病。2活性减低 见于先天性因子II、V、VII、X 缺乏症，但较少见。获得性减低者见于维生素K 缺乏症、肝脏疾病（最多和最先减少的是因子VII，其次和中度减少的是因子II和X，最后和最少减少的是因子V）、DIC 和口服

45、抗凝剂等。在血循环中有上述凝血因子的抑制物时，这些因子的血浆水平也减低。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子II、V、VII、X促凝活性测定 应用评价,目前因子II:C、V:C、VII:C、X:C的测定主要用于肝脏受损的检查，因子VII:C下降在肝病的早期即可发生；因子V:C的测定在肝损伤和肝移植中应用较多。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子VIII、IX、XI、XII促凝活性测定,原理 待测血浆分别加入乏F、F、F和F基质血浆、白陶土-脑磷脂悬液和钙离子溶液，进行APTT测定。将正常人混合血浆与乏因子血浆混合，测定APTT，作出标准曲线。从各自的标准曲线中分别计算出受检血浆

46、中F：C、F：C、F：C和F：C相当于正常人的百分率（%）。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子VIII、IX、XI、XII促凝活性测定 操作,1空白管测定 取基质血浆、咪唑缓冲液、脑磷脂悬液及5 g/L白陶土生理盐水悬液各0.1ml，混匀，37水浴2min，加预温的0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。要求空白管测定时间控制在240s250s，其时间的长短可以用脑磷脂的浓度来调节。2标准曲线绘制 正常人新鲜混合血浆以咪唑缓冲液作1：10、1：20、1：40、1：80、1：160稀释。将各稀释混合血浆0.1ml、各种乏因子、的基质血浆0.1ml、脑磷脂悬液0.1ml和5

47、g/L白陶土生理盐水悬液0.1ml混匀，37水浴温育2min后，加入预温的0.05mol/L CaCl2溶液0.1ml，在37水浴中摇动，记录凝固时间。以1:10稀释的标本为100%促凝活性，稀释度对数作横坐标，凝固时间对数作纵坐标，在双对数曲线上绘制曲线或计算回归方程。3受检标本测定 取置于冰浴中的受检血浆以咪唑工作液作1：20稀释后，按上述操作取得凝固时间，通过标准曲线或回归方程，得出各因子活性再乘以2，即为受检血浆凝血因子活性的水平相当于正常人的百分率（%）。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,血浆因子V、IX、XI、XII促凝活性测定 参考区间,FV:C：103.0%25.7%；FIX

48、:C：98.1%30.4%；FXI:C：100.0%18.4%；FXII:C：92.4%20.7%。注意事项1缺乏某因子的基质血浆应保证相应凝血因子的活性少于1%，而其它因 子水平正常。2样品采集后应在2h内完成测定，或分离血浆后置于-80冰箱中，2 3个月内检测并避免反复冻融。3受检标本检测凝固时间不在标准曲线范围可稀释后检测。4所有标本包括正常新鲜混合血浆检测前都应放置在冰水浴中。5每次测定都应做标准曲线。至少选择30人以上制备正常新鲜混合血 浆，冻干-80可保存3个月以上。可用商品化的APTT试剂代替脑磷脂 悬液和白陶土生理盐水悬液，但浓度需另做调整。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,

49、血浆因子VIII、IX、XI、XII促凝活性测定 临床意义,F：C在急性时相反应时可明显升高，在严重肝实质损伤时，F：C可明显升高。F：C减低时，需与vWF含量同时测定，以筛选出vWF缺陷的可能。1增高 血浆中凝血因子V:C、IX:C、XI:C水平增高，主要见于血栓前状态和血栓性疾病，如静脉血栓形成、肺栓塞、妊娠高血压综合征、晚期妊娠、口服避孕药、肾病综合征、恶性肿瘤等。肝病时，因子V:C增高。2减低 因子V:C减低见于血友病甲（其中重型1%；中型2%5%；轻型6%25%；亚临床型26%45%）、血管性血友病（尤其是I型和型）、DIC、血中存在因子V抗体（此情况少见）。因子IX:C减低见于血友

50、病乙（临床分型同血友病甲）、肝脏疾病、DIC、VitK缺乏症、口服抗凝剂及抗IX因子抗体存在等。因子XI:C减低见于XI因子缺乏症、DIC、肝脏疾病以及抗XI因子抗体存在等。因子X:C减低见于先天性因子X缺乏症、DIC、肝脏疾病以及部分血栓病患者。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,凝血因子X定性试验,原理 在钙离子作用下，因子X能使溶于尿素或单氯乙酸的可溶性纤维蛋白单体聚合物转变为不溶性的纤维蛋白凝块，不再溶于尿素或单氯乙酸溶液。如受检血浆中缺乏因子X，则血浆凝块可再行溶解。,第十三章 第三节 血液凝固及检验,凝血因子X定性试验 操作,1受检血浆0.1ml,加0.025mol/L CaCl2