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1、实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳,一、实验目的,1.了解电泳的基本原理；2.掌握电泳分离蛋白质的原理；3.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法。,二、实验原理,1.电泳的基本原理 电泳是带电粒子在电场中向其电性相反的电极发生移动的现象。利用电泳技术可进行物质分离、纯化及鉴定。,影响带电粒子电泳速率的因素：带电量 F=qE分子量形状,2.电泳分离蛋白质的原理,蛋白质的两性解离：,等电点 即 pI(isoelectric point）,pI,pH小于pI,pH大于pI,当pH距离pI越远时，所带电量越多。,+OH-,+OH-,+H-,+H-,血清蛋白质的等电点为4.87.5，均低于8.6，因此电泳时常
2、采用pH8.6的缓冲液。此时，蛋白质解离带负电荷，在电场中向正极移动。,3.醋酸纤膜薄膜电泳分离血清蛋白质原理,醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支持物的一种电泳技术。醋酸纤维素薄膜做区带电泳的支持物优点:,1.用样量少，分离清晰，对染料无吸附作用;2.快速简便，应用范围广;3.染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析。,目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。,三、主要试剂与器材,试剂：血清 巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜（28 cm）血清加样器,四、操作步骤,1.浸膜：将裁好的醋酸纤
3、维素薄膜浸泡于缓冲液中，充分浸透后用镊子取出（约3-5 min，直到膜上没有斑点，中间没有气泡为止）。2.点样：毛面向上，用点样器，在距膜一端约1.5 cm处，点加3-5 L待分离血清。注意取样适量、均匀；血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。,3.搭桥：首先将双层纱布铺好，分别放置于电泳槽两端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄膜光面向上平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的方向，点样的一端位于负极，点样线不能搭在滤纸上。,醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图,4.电泳：红正黑负。电压120 V。电泳时间约40 50 min。5.染色：氨基黑10B,染色1-2 min.6.脱色：2个表面皿，装入漂洗液，依次漂去多余染料，直到背景漂白为止。,五、结果与分析,1.定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。2.定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法,六、临床意义,血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。1肝硬化时清蛋白明显降底，2和-球蛋白无显著变化，而球蛋白可显著增加。正常生理情况，清蛋白与球蛋白之比约为1.52.51，而肝硬化时有可能出现清球1的情况，常称为清、球比例倒置，说明肝功能严重受损。,
