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1、重组DNA技术（基因工程）,基因工程基因工程的风险和伦理学问题,基因工程,基因工程概述基因工程的相关技术基因工程的工具酶载体基因工程的基本步骤基因工程的应用,基因工程的概念genetic engineering,基因工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的基因工程包括：整体水平，如生物的有性杂交；细胞水平，如细胞融合；分子水平，染色体工程、基因克隆等。狭义的基因工程即是通常讲的基因克隆。目的:是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。,基因工程的概念genetic engineering,定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细
2、胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的基因操作技术。,基因工程重要特征：,可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能,基因工程技术路线,DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）DNA片段和载体的连接重组体DNA外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库筛选目的克隆 基因表达与产物分离,基因工程的相关技术,核酸的分子杂交聚合酶链式反应(polymerase chain
3、 reaction):PCR和RT-PCR(reverse transcription PCR),核酸的分子杂交,Southern blot-DNANorthern blot-RNAIn situ hybridizationFluorescent In situ hybridization,Southern blot,Northern blot,analysis of BLTR mRNA,Tracing and Assaying Molecules Inside Cells,In situ hybridization for RNA localization in tissues.,Fluor
4、escent In situ hybridization,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR),聚合酶链式反应是体外快速扩增DNA的方法。PCR反应包括三个步骤：变性(denature)：在94-95使模板DNA的双链变性成单链；低温退火(annealing)：两个引物分别与单链DNA互补复性；延伸(extension)：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互补链。这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。,RT-PCR,限制性内切核酸酶,限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction enzymes)是细菌中这些酶的
5、功能是降解外来DNA分子的一类酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染。限制性酶据其作用特点，可分为两类。第类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性。第类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。第类限制性酶识别的序列是对称的，即在一条链中从5到3方向的序列，与其互补链从5到3方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)。,限制性内切核酸酶,粘性末端平整末端,其它工具酶,T4 DNA连接酶(ligase)反转录酶（reverse transcriptase),载体(vector),一
6、个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。,载体DNA分子，需要具备：,具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制，具有多克隆位点(multiple cloning site,MCS)，而每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内。至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的
7、宿主细胞具有易鉴别的表型。易从宿主细胞中回收。较小的相对分子量和较高的拷贝数。有安全性。,载体(vector)的种类,细菌质粒载体噬菌体柯斯质粒(cosmid)穿梭载体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）Ti质粒,细菌质粒载体,质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。现在广泛使用且商品化的质
8、粒，很多都具有重组表型检测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。,噬菌体,噬菌体基因组全长49kb。噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇，位于两端的为DNA左、右臂。基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。,柯斯质粒(cosmid),柯斯质粒(cosmid)是利用部分噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而
9、成的。柯斯质粒具有噬菌体的cos序列(12bp)和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。可接受长达50kb的外源DNA片段。,穿梭载体是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列以及选择标记性状，具有多克隆位点。,穿梭载体,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）,根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱
10、导瘤细胞(tumor-inducing,Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA(transfer DNA,T-DNA)，当T-DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine),作为土壤农杆菌的碳源和氮源,Ti质粒,基因工程的基本步骤,基因的获得阳性克隆的分析与鉴定目的基因与载体连接(DNA分子重组)目的基因导入受体产品表达和纯化,基因的获得,(一)从基因库中分离基因 大多数方法是利用一段核苷酸序列作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。如菌斑杂交法(plaque hyb
11、ridization)筛选噬菌体核基因库。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(三)人工合成基因(四)RT-PCR,阳性克隆的分析与鉴定,限制性酶图谱,阳性克隆的分析与鉴定,核酸序列分析,目的基因与载体连接(DNA分子重组),DNA分子重组,目的基因导入受体,植物基因工程过程,小结,在基础研究中的应用在农业和工业上的应用在医学中的应用：基因工程用于生产蛋白质类药物基因工程用于疫苗生产基因工程用于基因治疗遗传疾病诊断 RFLP 法,基因工程的应用,在农业和工业上的应用,1.增加农作物产品的营养价值，如：增加种子、块茎的蛋白质含量，改变植物蛋白的必需氨基酸比例等。2.提高农作物抗逆性能如：抗病虫
12、害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能。3.提高光合作用效率将是提高农作物产量的一个有效方法。4.生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂。,在农业和工业上的应用,5.增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25%，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等。6.运用转基因动物的技术，可培育畜牧业新品种。7.“吃油”工程菌8.纤维素酶,不易腐烂的番茄,动物植物的遗传改良,抗虫植物 化学农药,兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽。,Trans
13、genic mice10 weeks44g and 29g,转基因动物,人胰岛素 从猪和牛的胰脏提取，获得100g胰岛素需8001000kg的牛胰脏。现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。人生长激素 具有物种特异性，只能用人的生长激素来治疗侏儒症。以前从尸体脑垂体中提取，来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。干扰素 体外培养人体细胞来生产，产量低，成本高，现用重组大肠杆菌生产。,在医学中的应用,基因工程用于疫苗生产,常用的制备疫苗的方法，一种是弱毒活疫苗，一种是死疫苗。两种疫苗各有自身的弱点。活疫苗隐含着感染的危险性。死疫苗免疫活性不高，需加大注射量或多次接种。利用基因工程制
14、备重组亚基疫苗，可以克服上述缺点，亚基疫苗指只含有病原物的一个或几个抗原成分，不含病原物遗传信息。重组亚基疫苗就是用基因工程方法，把编码抗原蛋白质的基因重组到载体上去，再送入细菌细胞或其他细胞中区大量生产。这样得到的亚基疫苗往往效价很高，但决无感染毒性等危险。在酵母中表达乙型肝炎表面抗原 HBsAg 产量可达每升 2.5mg，基因工程生产疫苗有良好的发展前景。,基因工程用于基因治疗,人体基因的缺失，导致一些遗传疾病，应用基因工程技术使缺失的基因归还人体，达到治疗的目的，已成为基因工程在医学方面应用的又一重要内容。目前已有几种基因治疗方法。其中最常用的基因转移治疗方法是利用减毒的病毒DNA(retro virus DNA)作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组减毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。,Therapy for Severe Combined Immunodeficiency Disease(SCID),遗传疾病诊断,RFLP 法,克隆羊,克隆羊试验成功打开了广泛应用的大门蛋白质肽类药物的生产器官移植挽救珍稀濒危动物良种牲畜的繁育用于研究的动物模型的建立,Dolly and her daughter,The process of cloning Dolly,基因工程面临的问题：,（1）转基因生物的环境风险（2）转基因生物的安全和伦理问题,
