《质粒DNA的提取及定量定性分析.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒DNA的提取及定量定性分析.ppt（22页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、Q&A,关于PCR结果分析关于产物回收漂洗作用：换缓冲液，除杂乙醇：保存目的产物离心：去乙醇，除液体，保证后续工作补救：勿轻易弃置；高盐结合，重复漂洗。关于,1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12,Fig.1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products.Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA marker（from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）,相邻泳道溢出污染,非特异性！,！PCR仪中的位置,边缘效应？,！
2、,胶融！外溢,胶融！,质粒DNA的提取及其定性定量分析,基因的克隆与表达专题之二,主要内容,一、质粒DNA提取二、琼脂糖电泳鉴定及半定量三、紫外吸收定量及纯度检测,基本原理,结构差别分子量差别变性复性,SDS碱裂解,碱裂解 碱变性,一、质粒DNA的提取流 程,接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜4000rpm、离心1min，收集所有菌体150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清,接菌,培养,收菌,碱裂解,加入200
3、uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心10min上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min,复性回收,纯化,上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min12000rpm，离心10min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心5min沉淀于超净台中风干（5min20min）沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解-200C保存,醇沉回收,溶解,保存,离心标识,碱裂解,溶液冰浴pH 8.0剧烈振荡10 mi
4、n溶液粘稠混浊,碱裂解,溶液现用现配切勿振荡！颠倒混匀T 5minSDS包被,！,复性回收,溶液冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀15min仅质粒复性？在哪相？,！,制 胶：1%琼脂糖（20 mL，1xTAE)缓冲液：1xTAE，130 mL制 样：质粒DNA 2L 10 xloading 0.5LMarker：5L电 泳：80伏恒压结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量,二、质粒DNA的电泳,测定流程：质粒DNA稀释100倍（用TE缓冲液稀释），总体积300 L检测波长：定量：C=OD260*50*稀释倍数（g/mL）纯度指标：,三、质粒DNA的紫外吸收检测,260nm核酸280nm蛋白,下次实验的简介与准备,DNA 重 组酶切和连接,基因的克隆与表达专题之三,预习：在实验中如何进行对照？思考：工程菌的常用种类及用途？质粒的种类及特性？分子生物学中常用的内切酶？连接酶？抗生素种类？为什么应用抗生素？灭菌：1mL、200L、10L枪头各一盒 1.5mL小指管 40个,加油啊！,关于PCR退火条件摸索,
