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1、,质粒的快速抽提,复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系,实验背景简介:什么是质粒?,扩增,质粒DNA,细菌染色体 DNA,质粒,目的基因,实验原理,1 碱裂解细菌 NaOH 染色体DNA变性 SDS 蛋白质变性,2 低温下用KCL沉淀变性的蛋白质和 染色体DNA,3 离心后从上清中分离出质粒DNA,实验原理,裂解,沉淀离心,实验步骤,1 细菌扩增 在原始平板上挑取待筛选菌落,接种到含AMP的LB液体培养基中,置于37度恒温摇床以200bpm的速度振荡培养过夜.2 收集细菌 每个Eppendorf管收集1ml菌液,12000g离心后去除上清.以上步骤由教师完成,学生从第三步开始做.,3 重悬
2、 每一Eppendorf管中加入50ul试剂1(10 mM EDTA pH 8.0),在涡流震荡器上震荡30秒重悬细菌.4 裂解细菌 每一Eppendorf管加入50ul新鲜配制的试剂2(0.2M NaOH,0.5%SDS,20%蔗糖),震荡30秒.70度水浴5分钟.5 沉淀细菌DNA及蛋白,分离出质粒DNA 每管加入1.5ul试剂3(4M KCL)和0.5ul试剂4(0.4%溴酚蓝溶液),震荡30秒,冰浴5分钟.4度12000g离心3分钟.6 制备0.7%琼脂糖凝胶(含0.5ug/ml EB)7 电泳 取上清50ul上样于样品槽,电泳(电压5-10V/cm胶),待染料迁移至全胶长度2/3-3
3、/4时,停止电泳,紫外检测电泳结果.,DNA的琼脂糖凝胶电泳,1 琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过(1-3)和(1-4)糖苷键交替构成的螺旋纤维2 决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素:DNA分子的大小和DNA构象 琼脂糖浓度 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭(EB)电压 琼脂糖种类 电泳缓冲液 等,DNA分子大小及构象对电泳迁移率的影响,1 双链DNA分子在凝胶迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比:分子越大,迁移越慢2 超螺旋环状（SC）、切口环状（OC）和线状（L）DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。,配制琼脂糖凝胶的注意事项,1 微波炉加热到熔化2 放置冷却至60后 加入 溴化乙锭（EB）3 待胶凝固完全后上样电泳4 注意电泳的正负极接口（红色-正级 黑色-负极）电泳方向为负 正,致癌物：注意戴手套防护,实验结果分析,思考题,为什么不同构象的DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中具有不同的迁移率?在凝胶中添加溴化乙锭的作用原理是什么?溴化乙锭有哪些毒副作用?应如何避免?,Thank you!,
