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1、1,第六章 基因克隆的技术路线,2,基因工程（上游）大体步骤,获取目的基因,目的基因与载体连接,连接产物导入细胞,目的基因表达,逆转录PCR法PCR法直接调用法,各种质粒各种病毒皆经改造,原核细胞真核细胞哺乳动物细胞植物细胞,3,第一节获得目的基因,4,直接分离目的DNA 经限制酶切割，电泳分离DNA片断。适用于获得细菌、质粒、病毒等低等生物的基因片段。真核生物的染色体DNA中含有内含子序列，不适合于基因工程的需要。,5,2.cDNA文库,The cDNA library:contains only complementary DNA molecules synthesized from mR
2、NA molecules in a cell.以mRNA为模板，逆转录合成的互补DNA。以此得到的某种细胞内所有mRNA的cDNA，称为cDNA文库。,6,3.RT-PCR,基本原理：将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。,7,第二节 重组DNA分子的构建,8,Link of cohesive end,粘末端连接,一.目的基因与载体的连接,9,Link of blunt end,平末端连接,10,平末端连接,Recombinant DNA,T4 DNA ligase,vector,1,11,平末端连接的缺点*more difficult ligation 连接困难
3、*2-direction insertion 双向插入*self-reconnection 自身环化*no easy way of retrieving the insert 重新筛选插入的片断困难,12,vector,1,2,vector,1,2,A,A,B,A,B,平齐末端连接时，插入的方向是随机的，称为双向插入。会给后续的工作造成很多麻烦。,13,EcoRI,EcoRI,单酶切粘末端连接,14,单酶切粘末端连接的特点,优点*Using the same one enzyme to cut 用同一种酶切*Ligated easily and coveniently 连接容易方便缺点*Sel
4、f-reconnection of vector 载体自身环化*Inserted in two directions 双向插入,15,单酶切粘末端的双向插入,GCTTAA,AATTC G,AATTC G,GCTTAA,GCTTAA,AATTC G,GCTTAA,AATTC G,16,17,AATTCxxxxxxA GxxxxxxTTCGA,G AGCTTCTTAA A,GAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAA,ligase,双酶切粘末端连接,EcoRI HindIII,EcoRI HindIII,18,双酶切粘末端连接的特点,*Using the same tw
5、o enzymes to cut*Ligated easily and conveniently*no self-reconnection of vector*Inserted in one direction 定向插入缺点 操作比较麻烦。如果两种酶要求的条件不同，需要进行两个阶段的反应。,19,几种实验方法,利用相应的技术方法，使实验顺利进行。,20,Link of homopolymeric tails,添加同聚尾避免质粒的自身环化,末端转移酶,21,添加接头，引入限制酶的切割位点，然后用相应的酶切割。,22,野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统，会切割外源DNA分子。因此用于基因
6、工程的受体菌，需经筛选和人工改造。,第三节 重组子导入细胞,23,外源DNA转入细胞的过程叫做转化。但不包括由病毒介导的DNA转入。常用的方法有两种：,24,The first is a chemical method utilizing CaCl2 and heat shock to promote DNA entry into cells.氯化钙法：利用氯化钙和热休克使受体菌成为感受态细胞，促进外源 DNA的进入。,25,宿主细胞与重组DNA在00C的氯化钙溶液中孵育，快速转入420C造成热休克。经此处理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受态细胞。,26,处理宿主细胞低渗溶液热休
7、克 E.coli+0.1M CaCl2 competent(E.coli)cells 被转化的宿主细胞,Low-osmosis makes cell expanding,0-4,Recombinant DNA+42,Heat makes cell more expanding and membrane more permeable,27,处于感受态的细菌表面正电荷增加，细胞膜的结构有改变，通透性增强，转化子易于进入细胞。,28,其他处理受体细胞的方法,利用二甲基亚砜（DMSO）处理细胞二巯基苏糖醇（DTT）处理细胞。利用聚乙二醇（PEG）处理细胞。,29,When competent cell
8、s are mixed with DNA，some cells(actually,very few)become transformed:they acquire recombinant vector DNA.,Pseudo-positive,positive,30,第四节 重组子的筛选与鉴定,31,After transformation，only a few cells take up the plasmid DNA，and there only has one recombinant molecule in one recipient cell(受体细胞)，so a method is
9、needed for selecting those 转化步骤后，转进重组质粒的细胞是较少的。因此需要挑选出含有重组子的细胞。,32,Direct selection 直接筛选Antibotic resistance 抗菌素抗性Marker rescue selection 借助颜色筛选In situ hybridization 原位杂交Immunology selection 免疫筛选Immunochemistry method 免疫化学Enzyme immunodetection assay 酶免疫分析,33,质粒载体带有氨苄青霉素抗性基因，在宿主细胞内该抗性基因表达出可水解氨苄青霉素的酶
10、，因而宿主细胞可在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长。,利用抗生素抗性筛选,34,复制起点,氨苄青霉素抗性基因,35,36,37,2.利用颜色筛选 插入失活现象,X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷,38,多克隆位点,半乳糖苷酶的基因内有多克隆位点，酶切插入外源DNA后，该基因无法表达.,39,40,完整的LacZ基因内，经过改造加入了多克隆位点，但并不影响LacZ基因的表达。当质粒转化细胞后，完整的LacZ基因表达产物与细菌的有关基因表达产物共同组成有功能的半乳糖苷酶，该酶把无色的X-gal切割成半乳糖和蓝色的5溴4氯靛蓝，使得菌落呈现蓝色。,41,表示外源基因插入编码半乳糖苷
11、酶的基因区段,42,43,44,蓝色菌落无插入序列,白色菌落含插入序列,转化菌具有氨苄青霉素抗性，可在 加有氨苄青霉素的平板上生长。,45,使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。1.载体自身环化，产生蓝色菌落；2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。3 未转化的细胞，不能生长。,46,47,Blue colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pVector and express a functional alpha fragment from an intact LacZ alp
12、ha coding sequence.White colonies represent Ampicillin-resistant bacteria that contain pInsert and do not produce LacZ alpha fragment.,48,49,3.In situ hybridization 原位杂交 生长在琼脂糖平板上的菌落，可定点转移到硝酸纤维素膜上，加入放射性的探针（即带有 放射性的与目的片断互补的核酸片断），与菌落杂交。经洗涤后的膜与X光胶片作用，挑选出阳性克隆。,50,51,DNA hybridization,52,53,54,55,56,免疫法筛
13、选,外源基因在细胞内表达出的蛋白质，可与特异性的抗体结合。,57,利用抗体筛选原理 目的基因编码的蛋白质作为抗原，用特异性抗体与之反应，再根据颜色等变化，筛选出菌落。方法 在琼脂平板上的菌落，转移到尼龙滤膜上，若某菌落带有目的基因，并可表达该目的基因所编码的蛋白质，则加入该蛋白质的特异抗体，可与该菌落结合，附着在滤膜上，不会被洗掉。该抗体可携带酶或荧光，易于检测。,58,Screening with antibodies is used when cloned gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein ar
14、e available.,59,第五节 基因表达产物的鉴定,60,基因表达,基因表达指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译成蛋白质的过程。,61,研究基因表达的手段,1、RT-PCR(RNA)2、Northern blot(RNA)3、Western blot(蛋白质）4、免疫组化（蛋白质）,62,1、RT-PCR,基本原理：将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。根据PCR产物的量，判断基因表达的强度。,63,2、Northern blot,标记探针与膜固相RNA杂交。根据杂交信号强弱判断表达量，根据杂交信号位置判断分子长度。,杂交信号,64,实验操作：,1）RN
15、A提取2）RNA电泳（分离不同长度RNA)3）转膜(形成固相RNA)4）探针标记（同位素/非同位素）5）杂交6）洗膜7）显影（放射性/酶促反应）,65,Northern blot 特点：,因为没有扩增过程，Northern blot 的结果可靠性高。可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。,优点：,缺点：1、操作烦琐2、使用同位素可能污染环境3、灵敏度低4、对RNA质量要求高,66,3、Western blot,标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。根据信号强弱判断蛋白表达强度。根据信号位置判断蛋白分子量。,标准分子量蛋白,特异性反应带,67,1）蛋白提取2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白）3）转移4）封闭5）一抗作用6）标记二抗（HRP/AP标记）作用7）显色,实验操作：,68,Western blot 特点：,优点：直接检测蛋白质的表达量。,缺点：灵敏度低一抗制备难度大，购买价格高,69,氨基酸序列测定,测定N端的1015个氨基酸测定C端的5个氨基酸样品需精制价格较高,
