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1、第12章 转基因生物反应器,12.1转基因生物反应器,一、转基因生物反应器（Transgenic bioreactor）：将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。,转基因微生物生物反应器：由于微生物结构简单、繁殖迅速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化获得所需要的目的产物，生产的药物属于第一代基因工程药物。转基因植物细胞生物反应器：将外源基因转入植物细胞，表达制备相关产品。由于植物细胞大规模培养技术限制，目前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定难度。转基因动物细胞生物反应器：
2、将外源基因转入动物细胞，表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。转基因动植物生物反应器：将外源基因转入动植物个体，表达制备相关产品。转基因动植物技术不仅限于转基因技术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因此过程复杂。,12.2 转基因动物细胞生物反应器,大多数哺乳动物蛋白翻译后的修饰，例如：糖基化、磷酸化和乙酰化等，是保持生物学活性、稳定性及抗原性的前提,例子：tPA,第一个哺乳动物细胞表达生产的医用蛋白,是溶血栓药物组织型纤维酶原激活剂（Tissue plasminogenactivator，tPA）。,促红细胞生成素,人体中
3、的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，为分子量67万的糖蛋白。药用价值：能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比）。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达制备促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）,12.3转基因动物(P259),一、概念与发展历史转基因动物：是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。,发展历史:1974年，Jaenish等应用显微注射法，在世界上首次获得AV40DNA转基因小鼠 1980年，Gordon等人育成带有人胸苷激酶的转基因小鼠,1983年，
4、Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中,获得“硕鼠”随后的十几年时间里，转基因的兔、绵羊、猪、牛、山羊、鱼、鸡陆续育成。,你看到过这样漂亮的老鼠？,二、转基因动物的制备,(一)原理方法1、基本原理转基因动物培育的基本原理是借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞/受精卵/卵细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源基因的转基因动物。,2、转基因动物的技术（方法）,培育转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的制备，外源目的基因的有效导入，胚胎培养与移植，外源目的基因表达的检测等。核心技术
5、是如何成功地把目的基因转入,1）目的基因的制备(分为二步)第一步：目的基因的获得第二步：目的基因的克隆,2）目的基因的导入(核心技术),（1）原核期胚胎基因显微注射法：通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵基本步骤目的基因的制备与纯化卵供体动物和假孕动物的准备超排卵、受精与取卵基因显微注射:将纯化的目的基因注射到受精卵的雄性原核内受精卵移植目的基因的表达整合鉴定和检测,特点：用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5%；导致基因组的重排、易位、缺失等。,（2）胚胎干细胞移植法：将正确整合的转基因ES细胞培养后进行核移植或
6、注射到处于胚泡期的供体胚胎，将胚胎移植到代母的子宫内。特点：转基因的效率高可能得到嵌合体,（4）精子载体导入法：这一方法的独特步骤包括：外源目的基因导入精子：可通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法等方法实现。被导入外源目的基因的精子与卵子受精。方法有人工授精、壶腹部手术授精、体外授精等，最终获得转基因动物。特点：经济、方便、转染率高,（4）反转录病毒感染法：将含目的基因的反转录病毒载体人为感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生转基因动物。特点：基因转移效率、感染率、整合率明显高于其他基因转移方法。但不能完全杜绝反转录病毒在转基因动物生产的商品中的污染。,（5）卵母细胞显微注射法 基本
7、方法：将带有外源目的基因的反转录病毒通过显微注射技术注入卵母细胞的卵周腔，通过体外受精，胚胎移植获得转基因动物。优点（262）适合制备大型转基因动物 对卵的机械损伤小 提高外源基因与核染色体接触的机会 提高外源基因的整合率,（6）转基因克隆动物方法：外源目的基因导入能进行体外培养的动物细胞，再以这些细胞作为核供体，利用克隆动物技术获得转基因动物。优点（262）获得转基因动物的效率高 通过鉴别核供体核型预知转基因动物性别 所需动物数量大为减少 实现大片段基因转移,思考题：在上述的六种转基因方法中哪些可能得到嵌合体动物？,（二）转基因动物鉴定技术,用PCR、Southern bolt(DNA印迹)
8、、荧光原位杂交等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定用RT-PCR、Northern blot(RNA印迹)和Western blot（蛋白质印迹）等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。,三、转基因动物技术的意义,1、研究基因的结构和功能及其表达与调控 2、转基因动物模型与基因治疗3、优良动物的育种：通过转基因可获得生长快速、品质良好、抗病力强、产量高的动物品种。4、在医药领域：通过相应转入目的基因的动物获得所需的药物5、在异种器官移植中，通过转基因技术以期获得人类所需的不被免疫排斥的器官。,转基因动物反应器,生物反应器：P263265优点：易养殖、通过乳腺和血液制备活性物质简单易行不足：制
9、备转基因动物成本高 易产生一些伦理问题,中国工程院院士、上海医学遗传研究所所长曾溢滔院士透露，转基因动物生产药物具有成本低、周期短、效益好的三大优势，“生产1克药物蛋白，用传统工艺的生产成本大约要4万元，而利用转基因动物却只需4元。”他还指出，有专家预测，10年后全球转基因药物的销售额将超过2500亿美元；到2020年，全世界90%以上的药物都将通过转基因动物生产。曾溢滔院士预测称，目前一种新药从它的研制开发、通过药审、直到上市，约需1015年。如果利用转基因动物-乳腺生物反应器，新药生产的周期为5年左右。据悉，曾溢滔院士在1998年研制出转基因羊、1999年研制出转基因牛，这两项成果，震惊了
10、世界，并连续两年获得两院院士评选的十大科技进展。,12.4 转基因植物生物反应器,1.转基因植物（transgenic plant）：指将外源基因转入到植物的细胞或组织获得了新的遗传性状的植物。2.植物生物反应器：是指通过基因工程途径，以常见的农作物作为“化学工厂”，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其它一些次生代谢产物等生物制剂的方法。,3.研究进展最快的是生产各种疫苗用的抗原蛋白。1992年，美国人和率先提出了用转基因植物生产疫苗的新思路。此后，国内外相继在烟草、马铃薯、番茄、苜蓿和莴苣中表达了乙肝表面抗原、大肠杆菌热敏毒素B亚
11、基、霍乱毒素B亚基、诺瓦克病毒壳蛋白和狂犬病毒G蛋白等抗原，并利用在植物中表达的抗原进行了动物和人体的免疫实验，为利用转基因植物生产疫苗奠定了良好基础。已有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功表达,4.培育方法例子：西红柿疫苗,优点：,生物活性好：能进行有效的翻译后加工，是能够大规模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。构建容易：植物细胞易再生植株，生长周期短，易于快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间，而且技术更成熟，成功率更高。成本低：外源基因可以通过种子遗传给下一代，扩大种植大面积提高产量。使用安全：表达系统中的非目的成分对动物无害，不存在其他动物病原体污染的可能，对人畜安全。,不足：需进行安全性评价受季节和环境影响 需专门的分离设备与技术,
